Homolog Rekombinasyon

Dört kuyu ve iki bozuk yeşil gen

Nisanın ikinci haftasının cuması. Ovadan gelen ışık taş duvarın üstüne düşüyor; tezgâhın ortasında, kapağı buğulanmış dört kuyulu bir kültür tabağı duruyor. Zelal üç insan hücre hattının her birine aynı raportörü yerleştirmiş: yeşil floresan proteinin iki bozuk kopyası, yan yana. Birinci kopyanın ortasına mayadan alınmış bir kesim enziminin tanıma dizisi ve bir durdurma sinyali sokulmuş. İkinci kopyanın iki ucu kırpılmış; kendi başına hiçbir şey yapamaz, ama ortası sağlamdır. Kesim enzimi birinci kopyayı ikiye ayırınca hücre kopan uçları ikinci kopyadaki sağlam diziden okuyarak doldurursa gen düzelir ve hücre yeşil yanar.

Dört kuyunun yüzdeleri, hücreleri tek tek sayan cihazın çıktısında:

"Çarşambaki bütün halkalarda karşı zincir yerindeydi," diyor Zelal. "Burada iki zincir birden kopuyor. Hücre doğru harfleri nereden buluyor, ve neden kuyuların birinde neredeyse hiç bulamıyor?"

Mekanizma

Kalıbı yitirmiş kırık

Önceki üç onarım yolunun ortak varsayımı sağlam bir karşı zincirdi: glikozilaz bir bazı, ikili kesim bir parçayı, yanlış eşleşme onarımı yüzlerce nükleotidi söküyor, boşluğu karşıdaki harflerden yeniden yazıyordu.

Wikipedia'nın doğal DNA hasarları tablosu, Haber'in 1999 tahminine dayanarak hücre döngüsü başına yaklaşık on kırık verir; Vilenchik ile Knudson 2003'te PNAS'ta yaklaşık elli diye hesapladı ve bunun tek zincir hasarlarının yüzde birine denk geldiğini yazdı. Günde on binlerce tek bazlık hasarla kıyaslanınca az görünür. Ama bir kırık onarılmazsa kromozomun bir kolu bütünüyle yitirilebilir. Kaynakları kopyalama çatalının çentikli bir zincirde çökmesi, iyonlaştırıcı ışınım ve bazı kimyasallardır; replikasyon bozuklukları dersinde durmuş çatalları tartışırken bu ihtimale dokunmuştuk.

Brandsma ile Gent, Spies'ın ekibinin 2021 derlemesi ve Wikipedia aynı kısıtı vurgular: kardeş kromatit ancak DNA kopyalandıktan sonra, yani S ve G2 evrelerinde vardır. Hücre döngüsünün öbür evrelerinde başka bir yol ağır basar.

Uçları kemirmek

Kalıp aramanın ilk koşulu, arayacak tek zincirli bir uçtur. Zhao ile ekibinin 2020'de Experimental & Molecular Medicine'de yayımladığı derleme bu hazırlığı iki basamakta anlatır. MRE11, RAD50 ve NBS1'den oluşan MRN kompleksi CtIP ile birlikte 5' ucu kısa bir mesafe kırpar; Zhao bu mesafeyi yaklaşık yüz, Zhu ile Ira'nın 2008'de Cell'de mayada ölçtüğü değer birkaç yüz nükleotit verir. Ardından iki uzun menzilli makine devreye girer: biri EXO1, öbürü DNA2 nükleazının BLM helikazıyla ortaklığı.

Bu oyuncuların ikisini tanıyoruz. EXO1 çarşamba günü yanlış eşi içeren yeni zinciri söken ekzonükleazdı; BLM ise replikasyon bozukluklarında durmuş çatalları yeniden yürütmeye yardım eden RecQ ailesi helikazıydı. Açılan tek zinciri, son iki derste karşılaştığımız RPA hemen kaplar ve kendi üzerine katlanmasını önler. Zhou, Caron, Legube ve Paull 2014'te insan hücrelerinde kesimin bir kırıktan 3,5 kilobaza dek uzanabildiğini ölçtü.

Protein ipliğini örmek

RPA ile kaplı tek zincir henüz arama yapamaz. Krejci'nin ekibinin 2012 Nucleic Acids Research derlemesi, RPA'nın RAD51'den önce geldiğini ve onu yerinden etmenin ayrı bir "aracı" proteine bağlı olduğunu anlatır. İnsanda bu işin başlıcası BRCA2'dir. Liu'nun ekibi 2010'da arıtılmış tam boy insan BRCA2'sinin yaklaşık altı RAD51 molekülü bağladığını ve onları RPA kaplı zincire yüklediğini gösterdi.

Krejci ipliğin bir turunda altı RAD51 ve on sekiz nükleotit sayar: 18 ÷ 6 = 3, her molekül üç nükleotit tutar. Qi'nin ekibi 2015'te Cell'de bu üçlü düzeni tek molekül deneyleriyle ayrıntılandırdı. Zhao'nun yüz nükleotitlik kısa kesimi 100 ÷ 3 ≈ 33 molekülü taşır; Zhou'nun 3,5 kilobazı 3.500 ÷ 3 ≈ 1.170, kırığın iki yanı birlikte 2.300'ü aşar. Bakteride aynı işi RecA, uçların kesimini RecBCD yapar; Dillingham ile Kowalczykowski'nin 2008 derlemesi RecBCD'nin Chi adlı kısa bir diziye rastlayınca RecA'yı zincire yüklediğini anlatır.

Tabak bu basamağı okuyor. Zemin düşük: 6,0 ÷ 0,02 = 300, raportör kırık olmadan neredeyse hiç yanmıyor. RAD51 azaltılınca oran 6,0 ÷ 1,1 ≈ 5,5 kat düşüyor; düzey sıfırlanmamış, ip kısmen örülüyor. BRCA2'siz kuyuda 6,0 ÷ 0,3 = 20 kat. Moynahan, Pierce ve Jasin 2001'de BRCA2'si kusurlu hatlarda aynı türden ölçümde düşüşü, hatta bağlı olarak, altı ile yüzün üstünde kat arasında buldu; kurgu sayımız o aralığın içinde.

Kardeşte doğru yeri bulmak

İplik çift zincirli DNA'yı tarar ve tamamlayıcı diziye rastlayınca kendi zincirini o dizinin karşısına yerleştirir. Qi'nin mayada yaptığı ölçüme göre RAD51 ipliği sekiz nükleotitlik bir eşleşmede kararlı tutunuyor, yedide tutunamıyordu; ardından tutuş üçer nükleotitlik adımlarla büyüyordu.

Sekiz harfin tek başına ne kadar seçici olduğunu bir hesap gösterir. Dört harfli bir alfabede belli bir sekizli dizinin rastlantısal olasılığı 1 ÷ 4⁸ = 1 ÷ 65.536. Endojen hasar dersinde kullandığımız 6,2 × 10⁹ baz çiftine bölünce 6,2 × 10⁹ ÷ 65.536 ≈ 95.000 rastlantısal eş yer çıkar. Bir dizinin genomda ancak bir kez beklenmesi için 4¹⁷ ≈ 1,7 × 10¹⁰ gerekir, yani on yedi harf. Sekizli tutunuş yalnız bir başlangıç: iplik eşleşmeyi üçlülerle uzatırken uyumsuzluğa çarpan tutunuşları bırakır.

Burada çarşambanın ikinci görevi devreye giriyor. Yanlış eşleşme onarımının yüzde üç farklı diziler arasındaki zincir değişimini durdurduğunu, Rayssiguier'in bakteri türleri arasında rekombinasyon engelini bu sisteme bağladığını görmüştük. Arama kardeş kromatitte bire bir eşleşir; genoma serpilmiş, birbirine benzeyen ama özdeş olmayan tekrarlarla kurulan ara ürün ise yanlış eşler taşır ve bu denetimle dağıtılır.

İstilacı 3' ucu artık bir polimerazın ilmeği uzatarak kardeşteki diziyi kopyalayacağı bir başlangıç noktasıdır. Bu adımdan sonra yol ikiye ayrılır.

İki çıkış

Krejci'nin ve Wikipedia'nın anlattığı birinci yolda uzayan zincir D-ilmeğinden geri çekilir ve kırığın öbür ucundaki tek zincirle eşleşir; boşluklar doldurulur. Bu yol, sentez bağımlı zincir tavlanması (synthesis-dependent strand annealing, SDSA), mitozda tercih edilir ve kromozom kolları yer değiştirmez. Zelal'in raportöründe yeşili yakan sonuç da bu türdendir: kesik genin içi kalıptan doldurulmuş, komşu diziler yerinde kalmıştır.

İkinci yolda kırığın öbür ucu da ilmeğe tutunur ve iki Holliday kavşağı kurulur. Holliday kavşağını 1964'te gen dönüşümünü açıklamak için önerdi; Szostak, Orr-Weaver, Rothstein ve Stahl 1983'te çift zincir kırığı onarım modelinde ikili kavşağı yerleştirdi. Wu ile Hickson 2003'te Nature'da BLM ile topoizomeraz IIIα'nın ikili kavşağı birbirine doğru kaydırıp çözdüğünü, bu işlemin yan dizileri değiştirmediğini gösterdi. Matos ile West'in 2014 derlemesi BLM, topoizomeraz IIIα, RMI1 ve RMI2'den kurulu bu "çözünme" kompleksinin yalnız krossing oversız ürün verdiğini, MUS81, GEN1 ve SLX4 nükleazlarının ise kavşakları keserek krossing overlu ürün de çıkarabileceğini aktarır.

Replikasyon bozuklukları dersinde tanımladığımız kardeş kromatit değişiminin Bloom sendromunda neden on kat arttığı buradan okunur. BLM yoksa ikili kavşaklar çözünemez; işi nükleazlar devralır, kesilen kavşakların bir kısmı kardeşler arasında kol takası bırakır. Kardeşler özdeş olduğu için bu takas çoğunlukla sessizdir.

Modelin sınırı

• Raportör tek bir sonucu sayar. Brandsma ile Gent'e göre yeşili yakan kısa gen dönüşümüdür; uzun kopyalama ya da tekrarlar arası tavlanma gibi başka çıkışlar ölçümün dışında kalır.
• Mayadan alınan kesim enziminin açtığı kırık temiz uçludur. Işınımın ya da çöken çatalın bıraktığı uçlar kimyasal olarak kirlidir ve kesimden önce temizlenmeleri gerekir.
• Sekiz nükleotitlik eşik mayanın RAD51'iyle, tek molekül düzeninde ölçüldü. İnsan proteininde ve kromatin içinde aynı eşiğin geçerli olduğu doğrudan gösterilmedi.
• Azaltılmış RAD51 hattında protein kısmen kalır; 5,5 katlık düşüş, RAD51'in yokluğunu değil, azlığını ölçer. Yüzdeler ayrıca kesim enziminin hücreye ne verimle girdiğine bağlıdır.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• BRCA2 ve benzeri genlerde aileden taşınan değişikliklerin kanser riskini nasıl etkilediği ders dışıdır; bu soru modülü kapatan vaka dersine ve L05-P06-M03-D06'ya kaldı. Tanı, test seçimi ve risk değerlendirmesi hekimin işidir.
• Rekombinasyonu "güçlendirdiği" söylenen besin ya da ürünler bu yayınların hiçbirinde geçmiyor.

Tabak inkübatöre

Zelal tablonun altına üç bölme yazıyor: "6,0 ÷ 0,02", "6,0 ÷ 0,3", "6,2 × 10⁹ ÷ 4⁸". BRCA2'siz kuyunun yanına küçük bir not ekliyor: iplik örülmedi.

Hamiyet Hanım tabağı inkübatöre koyarken pencereye bakıyor. "Bugünkü bütün hücreler kopyalamayı bitirmişti, kardeşleri yanlarındaydı. Pazartesi kardeşi olmayan bir hücreye bakacağız."

Kendini sına

1. Kesim enzimi verilmemiş kuyunun 0,02'si ne ölçer ve olağan hattın 6,0'ı neden ona bölünerek okunur?
2. Kısa kırpmayı yapan kompleks olduğu hâlde uzun menzilli nükleazlar kapatılırsa iplik kurulabilecek tek zincirin uzunluğu nasıl değişir?
3. Bir RAD51 molekülü üç nükleotit tuttuğuna göre, 1.200 nükleotitlik tek zincir üzerinde kaç molekül dizilir?
4. Sekiz harflik bir tutunuş, 6,2 × 10⁹ baz çiftlik genomda neden doğru yeri tek başına belirleyemez? On yedi harf hangi hesaptan çıktı?
5. BLM yokken kardeş kromatit değişiminin artması ile kardeşler arası takasın çoğunlukla sessiz kalması nasıl bağdaşır?

Bir sonraki derse köprü

Bugünkü onarımların hepsi kopyalanmış bir sarmalın yanında duran kardeşine dayandı. G1 evresindeki bir hücrede böyle bir kalıp yoktur. Homolog Olmayan Uç Birleştirme dersi bu duruma bakacak: kalıp aranmadan, kopan iki uç doğrudan nasıl yeniden birleştirilir, ve uçları birbirine eklemenin bedeli dizide hangi küçük silmeler ya da eklemeler olarak kalır?