Yanlış Eşleşme Onarımı

Beş özüt, dört halka

Nisanın ikinci haftasının çarşambası. Perde bu kez toplanmış, morötesi lamba dolabına kaldırılmış. Tezgâhta beş küçük tüp buzda bekliyor: Zelal'in beş insan hücre hattından hazırladığı çekirdek özütleri. Biri olağan hücreden; ötekilerde sırasıyla MSH2, MSH6, MSH3 ya da MLH1 geni kapatılmış. Yanlarında dört tür halka DNA var. Üçünde tek bir G:T çifti bir kesim enziminin tanıma dizisinin ortasına oturtulmuş; G'yi taşıyan zincirde yaklaşık yarım kilobaz ötede bir çentik açılmış: birinde yanlış eşin 3' yanında, ötekinde 5' yanında, üçüncüsünde hiç yok. Dördüncü halkada G:T yerine aynı zincirde fazladan iki nükleotit duruyor.

G'nin A'ya dönmesi tanıma dizisini geri getiriyor, enzim halkayı ancak o zaman kesebiliyor. Kesilen halkaların yüzdesi şöyle:

Zelal masanın öbür ucunda bir de sayım bırakmış. Olağan ve MLH1'siz hattan ayrılan kırk sekizer alt klon otuz kadar bölünmeden sonra üç tekrar dizisinde okunmuş: beş A'lık bir dizi, on A'lık bir dizi, beş kez yinelenen bir CA. Uzunluğu değişmiş klon sayısı olağan hatta 0, 1 ve 0; MLH1'siz hatta 1, 22 ve 4.

"Pazartesinin dimerleri sarmalı büküyordu," diyor Zelal. "G de T de sağlam bazlar. Hücre neyi arıyor da bunu buluyor? Bulunca neden yarım kilobaz ötedeki çentiğe bakıyor?"

Mekanizma

Bükülmeyen hatayı yoklamak

Replikasyon hata düzeltmesi dersinde yanlış eşleşme onarımını kopyalamanın son süzgeci olarak tanımlamış, kaybının nokta mutasyonu hızını yüz ila bin kat artırdığını görmüştük; bölünme başına 0,6 olan hata sayısı 60–600'e çıkıyordu. Sistemin bakteride metilden, ökaryotta yeni zincirin çentiklerinden yön bulduğunu da orada öğrenmiştik. Bugün sistemin içine bakıyoruz.

Jiricny'nin Cold Spring Harbor derlemesi yanlış eşi iki biçimde tanımlar: kurallı olmayan bir baz çifti ya da iki zincirin birbirine göre kaymasıyla sarmalın dışında kalan birkaç nükleotit.

İnsanda tanımayı iki ikili protein üstlenir. Kunkel ve Erie'nin Annual Review of Genetics'teki 2015 derlemesi, Jiricny ve Wikipedia'nın mismatch repair maddesi aynı iş bölümünü verir: MSH2 ile MSH6'nın kurduğu MutSα tek bazlık hataları ve bir iki nükleotitlik ilmekleri, MSH2 ile MSH3'ün kurduğu MutSβ daha büyük ilmekleri tanır; küçük ilmeklerde ikisi örtüşür. Zhang'ın ekibinin 2005 Cell makalesinde arıtılmış insan proteinlerinden kurulan sistemde MutSβ baz-baz yanlış eşlerinde sınırlı kaldı, ilmekleri ise MutSα'dan verimli işledi.

Tezgâhtaki tablo bu bölüşümü okuyor. MSH6'sız özütte G:T sütunu çentiksiz halkanın düzeyine inmiş, iki nükleotitlik ilmek hâlâ yüzde 44 onarılmış. MSH3'süz özütte G:T neredeyse olağan, ilmek biraz düşük. MSH2 iki ikilinin ortak parçası; o yokken her sütun dipte.

Bükülmeyen hata nasıl bulunur? Cevap, proteinin sarmalı kendisinin bükmesidir. Lamers'in ve Obmolova'nın ekiplerinin 2000'de Nature'da yayımlanan iki kristal yapısında bakteri MutS'u DNA'yı kıskaç gibi sarıyor, yanlış eşin olduğu noktada sarmalı kıvırıyordu; iki alt birimden yalnız biri hatayla temas ediyordu. Jiricny bu temasın korunmuş bir fenilalaninle kurulduğunu yazar: halka sarmala girip yanlış baza istiflenir, yanındaki glutamat bazla hidrojen bağı kurar. Jiricny bükülmeyi 60, Fishel'in 2015 JBC derlemesi 45 ile 60 derece verir. Fishel'e göre yanlış eşli bölge kurallı çiftten esnektir; protein belki hatayı değil, kolay kıvrılan noktayı fark ediyor.

Hatadan ayrılan kıskaç

Hatayı bulan protein orada kalırsa kesim yarım kilobaz ötede nasıl başlar? Kunkel ve Erie'nin tarif ettiği akışta yanlış eşe bağlı MutSα ATP bağlayınca biçim değiştirir ve DNA boyunca hareket edebilen bir kıskaca dönüşür; ancak bu ATP'li hâliyle MLH1 ile PMS2'nin kurduğu MutLα'yı yanına çeker. Jiricny bu dönüşümde fenilalanin mandalının yanlış eşten çekildiğini, Fishel tek molekül gözlemlerinde ATP'li kıskaçların ATP yıkmadan sarmal boyunca kaydığını anlatır. Hatayı terk eden kıskaç yerini yenisine bırakır; böylece aynı yanlış eşten birden çok kıskaç yüklenebilir. DNA polimerazları dersinde PCNA'yı kayan kelepçe diye tanımlamıştık; MutS ailesi de ATP'yle benzer bir halkaya dönüşüyor.

Çentikten başlayan söküm

Modrich'in yolu açan deneyi bakteri özütüyle kurulmuştu. Ödülün bilimsel özetine göre yanlış eş iki kesim enziminin tanıma dizisine yerleştirilmiş, yaklaşık bin baz çifti ötede metillenmesi denetlenebilen tek bir GATC bırakılmıştı. Holmes'un ekibi 1990'da PNAS'ta aynı mantığı insan ve meyve sineği özütlerine taşıdı: çentik yanlış eşten 808 baz çifti uzaktaydı ve onarım çentikli zincire yöneldi. Jiricny'nin derlediği deneylerde kapalı halkalar onarıma direndi. Zelal'in çentiksiz sütunundaki yüzde 4 bu yüzden zemin; çentiğin katkısı 64 ÷ 4 = 16 kat.

Fishel ile Jiricny ökaryot tepkimesini iki yönlü anlatır: söküm çentikte başlar, yanlış eşin hemen ötesinde biter. Çentik 5' taraftaysa MutSα, 5'→3' ekzonükleaz EXO1 ve tek zinciri koruyan RPA yeter. Çentik 3' taraftaysa EXO1 o uçtan yanlış eşe yürüyemez; MutLα, RFC'nin yüklediği PCNA ile etkinleşip çentikle yanlış eşin biraz ötesi arasına yeni kesikler atar, EXO1 bu kesiklerden girer. Genschel ile Modrich'in 2003 Molecular Cell makalesi, 5' sökümün MutLα'sız da yürüdüğünü, 3' sökümün ise ona bağlı olduğunu bildirir. MLH1'siz satır tam bunu gösteriyor: 3' çentikte yüzde 5, 5' çentikte yüzde 41. Zemini düşünce olağanın 66 puanlık onarımının 37'si, kabaca yüzde 56'sı kalıyor. Boşluğu Pol δ doldurur; Zhang'ın sisteminde PCNA, RFC ve ligaz I de vardı.

Kunkel ve Erie EXO1'in tek yol olmadığını da yazar: EXO1'siz tepkimelerde Pol δ yanlış eşli parçayı zincir yerinden ederek yeniden yazabiliyor. Goellner'in ekibi 2014'te mayada bu EXO1'siz yolun PCNA'ya ve MLH1–PMS1 kesimine dayandığını gösterdi; Wikipedia da insanda iki alt yoldan söz eder.

Uzunluğu karşılaştırmak

Sökülen parça ne kadar? Fishel yüzlerce ile binlerce nükleotit yazar, Wikipedia birkaç nükleotitten binlerce baz çiftine uzanan bir aralık verir. Sınırı çentiğin uzaklığı çizer. Zelal polimerazı durdurulmuş bir tüpte boşluğu yaklaşık 560 nükleotit ölçmüş. Pazartesinin kesilen parçası 24–32 nükleotitti: 560 ÷ 32 = 17,5 ve 560 ÷ 24 ≈ 23. Geçen cumanın kısa yamasıyla 560 ÷ 1 = 560 kat.

Tekrar dizilerinde kayma

Jiricny kaymanın polimerazın ucunda olduğu durumda silme alanının onu yakalayabildiğini, ucun gerisinde kalan ilmeğin ise yalnız yanlış eşleşme onarımına bırakıldığını yazar. Tran'ın grubu 1997'de, mayada, kısa A dizilerinde hem düzeltme okumasının hem onarımın iş gördüğünü, sekiz ve daha uzun dizilerde yalnız onarımın mutasyonu önlediğini buldu. Strand'ın grubunun 1993 Nature makalesine göre onarım genleri bozuk mayada tekrar dizileri yüz ila yedi yüz kat kararsızlaşıyor, düzeltme okumasının kaybı ise az etki ediyordu.

Zelal'in sayımı aynı yönde: MLH1'siz hatta on A'lık dizi 48 klonun 22'sinde değişmiş, 22 ÷ 48 ≈ 0,46. Otuz bölünmeye bölünce bölünme başına kabaca 0,015 eder; aynı klonda iki kayma olabileceği için alt sınır sayılmalı. Beş A'lık dizi tek klonda değişmiş, uzun dizi 22 kat sık kaymış. Aynı on nükleotit uzunluğundaki CA dizisi dört klonda: Kunkel ve Erie de aynı harfin yinelendiği dizilerde tek baz eklemenin ya da silmenin aynı uzunluktaki iki harfli tekrarlardan çok daha sık olduğunu aktarır.

İki ek görev

Sistem yalnız kopyalama hatalarına bakmaz. Rayssiguier'in ekibi 1989'da E. coli ile Salmonella arasındaki rekombinasyon engelinin onarım genleri bozuk alıcılarda kalktığını gösterdi. Spies ile Fishel'in derlemesi ve Li'nin 2008 derlemesi, yanlış eşleşme onarımının çok farklı diziler arasındaki rekombinasyonu bastırdığını yazar; Worth'un ekibine göre MutS ile MutL, birbirinden yüzde 3 farklı faj DNA'ları arasındaki zincir değişimini durduruyordu. Bu ilişki homolog rekombinasyon dersinde yeniden karşımıza çıkacak.

Öbür görev hasarla ilgili. Jiricny ve York ile Modrich'in 2006 çalışması, eşi olmayan O⁶-metilguaninin karşısına konan timini onarımın sökmeye çalıştığını anlatır. Hasar kalıpta kaldıkça yeniden yazılan parça yine yanlış eş üretir, döngü tekrarlanır ve boşluklar sonraki kopyalamada çift zincir kırığına dönüşebilir. Onarımı eksik hücreler bu tür metilleyici hasarın öldürücü etkisine dirençlidir.

Modelin sınırı

• Kunkel ve Erie'ye göre tüp deneyleri yanlış eşler arasında en fazla on katlık bir verim farkını ayırabilir, hücre genetiği ise yüz bin katın üstünde bir yelpaze gösterir. Zelal'in yüzdeleri bu dar pencereden bakıyor.
• Halkalar çıplak DNA'dır; nükleozom, ilerleyen çatal ve öncü zincirdeki çentiklerin kaynağı tüpte yoktur. MLH1'siz özütün 5' çentikte onarabilmesi, MutLα kaybının hücrede güçlü mutatör olmasıyla çelişmez; tüp çentiği hazır veriyor.
• Kristal yapılar ATP'siz ya da ADP'li hâli gösterir. Fishel ATP verilince kristallerin dağıldığını not eder; kayan kıskacın biçimi yapıdan değil, kinetik ve tek molekül ölçümlerinden çıkarılıyor.
• Klon sayıları küçük; olağan hattaki tek klon oranı çok oynatır.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Bir mikrosatellit dizisinin uzunluğu, tek başına bir kişinin onarım kapasitesi hakkında bilgi vermez; buradaki sayımlar genleri bilerek kapatılmış kültür hatlarından geliyor.
• Bu genlerde aileden taşınan bozuklukların kanser riskini nasıl değiştirdiği, modülün onarım kusurlarını kanserle buluşturan vakasında ve kalıtsal sendromlara ayrılan L05-P06-M03-D06'da işlenecek.

Halkalar dondurucuya

Zelal tablonun altına üç hesap not ediyor: "64 ÷ 4 = 16"; "560 ÷ 1 ile 560 ÷ 32"; "on A: 22 / 48". MSH6'sız satırın ilmek hücresini yeşille daire içine alıyor: tek başına kalan MutSβ'nın izi.

Hamiyet Hanım halkaları dondurucuya yerleştirirken soruyor: "Bugünkü bütün onarımlar sağlam karşı zinciri kalıp aldı. Cuma iki zincir birden koptuğunda ne olacağına bakacağız."

Kendini sına

1. Çentiksiz halkanın yüzde 4'ü tabloda neyin ölçüsü, öteki sütunlar neden ondan düşülerek okunuyor?
2. MSH6'sız özütte G:T onarımı düşerken iki nükleotitlik ilmek neden hâlâ büyük ölçüde onarılıyor?
3. MLH1'siz özüt 5' çentikte onarabiliyor, 3' çentikte onaramıyor. EXO1'in yönü bu farkı nasıl açıklar?
4. Çentik yanlış eşten 1.200 nükleotit uzakta olsaydı sökülen parça Pazartesinin 30 nükleotitlik parçasının kaç katı olurdu?
5. Olağan hatta on A'lık dizide bir klonun değişmesi, onarımın kaymayı hiç görmediğine kanıt mıdır?

Bir sonraki derse köprü

Tezgâhtaki her halkada karşı zincir sağlamdı ve doğru harfi o verdi. Karşılıklı iki zincir aynı noktada birden koparsa kalıp nereden bulunur? Homolog Rekombinasyon dersi bu soruya kardeş kromatidi kullanan onarımla bakacak: kopan uçların nasıl işlendiği, kardeş kromatitte eşleşen dizinin nasıl arandığı ve bugün gördüğümüz, fazla farklı diziler arasındaki eşleşmeyi bozan denetimin bu aramada ne iş gördüğü sorulacak.