Nükleotit Eksizyon Onarımı

Üç kap ve bir küvet

Pazartesi sabahı, nisanın ikinci haftası. Karartma perdesi yine gerili; arkasında çarşambanın morötesi lambası. Kuvars küvette geçen haftanın saflaştırılmış DNA'sı duruyor, yanında kapakları açılmış üç kültür kabı: olağan insan deri fibroblastları, XPC geni kapatılmış bir hat ve CSB'si susturulmuş bir başkası. Lamba hepsine aynı kısa dozu verdi. Zelal ışınlamanın hemen ardından, birinci, dördüncü ve yirmi dördüncü saatte her kaptan DNA aldı ve iki antikorla zara emdirdi: biri siklobütan dimerlerini, öbürü altı–dört fotoürünlerini tanıyor. Çizelge sıfırıncı saatin sinyalini yüz kabul edip kalanı yüzde olarak yazıyor:

Hamiyet Hanım dördüncü saatin örneklerinde bir şeyi daha ölçtürmüş: etkin bir genin iki zincirini ayrı ayrı okuyup kalan dimeri saymış. Olağan hücrede genin okunan zincirinde yüzde 30 kalmış, karşı zincirinde 74. XPC'siz hatta 34 ile 97, CSB'siz hatta 86 ile 78.

"Küvette hiçbir şey eksilmiyor, demek ki silen hücre," diyor Zelal. "XPC'siz hat genomda neredeyse hiç onarmıyor ama genin okunan zincirini olağan hücre kadar hızlı temizlemiş. CSB'siz hatta tersi. Aynı hasarı iki ayrı göz mü arıyor?"

Mekanizma

Bükülmeyi arayan protein

Çarşamba pirimidin dimerinin sarmalı büktüğünü görmüştük. Bükülmenin ölçüsü iki ürün arasında çok farklıdır: Bee'nin ekibinin 2015 makalesi ile Kajitani'nin ekibinin 2022 makalesi, siklobütan dimeri için 7–9 derecelik bir kıvrım, altı–dört fotoürünü için 44 derecelik bir bükülme verir.

Genomun geneline bakan dalda ilk göz XPC'dir. Schärer 2013 derlemesinde XPC'yi, içinde hasar olsun olmasın, ısıl olarak gevşemiş çift sarmalı tanıyan bir protein diye anlatır; ortağı RAD23B bu bağlanmayı güçlendirir. Kusakabe'nin ekibinin 2019 derlemesi XPC'nin hasarlı bazla değil, eşleşmesi bozulmuş bazlarla temas ettiğini anlatır. Aynı derleme siklobütan dimerinin sarmalı az bozduğunu ve bu yüzden XPC'den kaçma eğiliminde olduğunu yazar. Açığı UV-DDB kapatır: DDB2 ile DDB1'den kurulu bu kompleks morötesi hasarına çok yüksek ilgiyle bağlanır ve XPC'yi oraya çağırır. Schärer DDB2 yokken XPC'nin dimerlerin bulunduğu noktalara gelemediğini aktarır.

Okunan zincirde takılan polimeraz

İkinci göz başka yerden bakar. Wikipedia'daki onarım maddesi, transkripsiyonla eşleşmiş dalın RNA polimerazı bir hasarda takılıp durduğunda başladığını yazar; duran polimeraz, XPC'nin bükülme arama işinin yerini tutan bir sinyaldir. Schärer bu dalın özgül etkenlerini CSA, CSB ve XAB2 diye sayar. RNA polimerazları gen ifadesi modülü ayrıntılı tanıtacak.

Çarşamba tütün imzasındaki zincir asimetrisini bu dala bağlamıştık; mekanizması burada. Polimeraz yalnız okuduğu kalıp zincirde takılır, karşı zincirdeki hasarı hiç görmez. Okunan zincirdeki katılma ürünleri bu yüzden daha erken temizlenir, mutasyona dönüşme şansı karşı zincirdekilerden azdır.

Açmak, doğrulamak, iki yerden kesmek

Tanımadan sonra iş TFIIH'ye geçer. Wikipedia'daki TFIIH maddesi bu kompleksi hem gen okumanın başlatılmasında hem de bu onarımda çalışan çok alt birimli bir yapı olarak tanıtır. İçindeki iki helikazdan XPD'nin helikaz ve ATPaz etkinliği onarım için gereklidir; Schärer ile Kusakabe'nin ekibi, XPB'de ise helikazın değil yalnız ATPaz etkinliğinin şart olduğunu yazar. Kusakabe'nin aktardığı modelde XPD, XPA ile birlikte zinciri 5'→3' yönünde tarar ve gerçekten onarılacak bir hasar olup olmadığını doğrular; açılan tek zinciri, kopyalamadan tanıdığımız RPA korur.

Kesim iki ayrı enzimle yapılır. Wikipedia ile Schärer aynı düzeni verir: XPG hasarın 3' tarafını, XPF–ERCC1 5' tarafını keser.

Hu'nun ekibinin 2015 Genes & Development makalesi insan hücrelerinden doğrudan alınan birincil kesim ürünlerini 24–32 nükleotit uzunluğunda bulur; Choi'nin ekibinin 2014 makalesi de tüpteki ikili kesimin 24–32 nükleotitlik parçalar ürettiğini aktarır. Wikipedia'nın 25–30 aralığı bununla örtüşür.

Bakteride iş daha az proteinle görülür. NobelPrize.org'un popüler bilim metni ve bilimsel özeti, Aziz Sancar'ın 1983'te saflaştırdığı UvrA, UvrB ve UvrC proteinleriyle morötesi hasarlı DNA'yı iki yerden kestirdiğini anlatır; özet kesimleri 5' tarafında sekizinci, 3' tarafında dördüncü veya beşinci fosfodiester bağına koyar. Çıkan parça 12–13 nükleotitti; Wikipedia'nın Sancar maddesi aynı uzunluğu verir. Aynı özet, bakteride üç proteinin gördüğü tanıma ve ikili kesim işi için insanda on beşten fazla protein gerektiğini, insan sisteminin 1995'te saflaştırılmış etkenlerle Sancar'ın ve Richard Wood'un laboratuvarlarında ayrı ayrı yeniden kurulduğunu yazar. Hamiyet Hanım çizelgeyi asarken bir ayrıntıyı hatırlatıyor: NobelPrize.org da Wikipedia da Sancar'ın Savur'da doğduğunu yazar; Savur, Mardin'in ilçelerinden biridir.

Boşluğu yeniden yazmak

Kesilen parça çıkınca karşı zincir kalıp olarak kalır. Wikipedia sentezi Pol δ, Pol κ ve Pol ε'a, kelepçe olarak PCNA'ya bağlar; son çentiği ya ligaz I ya da XRCC1–ligaz III bağlar. Schärer seçimi hücrenin durumuna bağlar: bölünmeyen hücrede ligaz IIIα ile Pol δ, bölünen hücrede ligaz I ile Pol ε öne çıkar.

Schärer bu ölçümün bu onarım yolunu kseroderma pigmentozuma bağlamayı mümkün kıldığını yazar. James Cleaver 1968'de Nature'da bu hastalığı taşıyan kişilerden alınmış hücrelerde morötesinden sonraki onarım sentezinin kusurlu olduğunu bildirdi; NobelPrize.org'un bilimsel özeti makaleyi bu başlıkla anar, Wikipedia da onu morötesi hasarı, bozuk onarım ve kanser arasındaki bağı gösteren çalışma diye tanıtır.

Kesilen parçayı okumak

Sancar'ın ekibi kesilen parçaları atık saymadı. Hu'nun 2015 makalesinde tanıtılan XR-seq yönteminde hücreden çıkan oligonükleotitler yakalanıp dizilenir; her okuma, onarımın genomun hangi noktasında ve hangi zincirde yapıldığını tek nükleotit çözünürlüğünde gösterir. Olağan hücrelerde dimer onarımı en çok genlerin kalıp zincirinde toplandı. Transkripsiyonla eşleşmiş onarımı ya da küresel onarımı eksik hücrelerde iki dalın payı ayrı ayrı görüldü ve eşleşmiş onarımın yalnız kalıp zincirde çalıştığı anlaşıldı.

Lindsey-Boltz'un ekibinin 2023 ölçümü Zelal'in çizelgesinin mantığını taşır: olağan fibroblastta dimerlerin yarısı sekiz saatte gider, CSB'siz hatta on altı saatte; XPC'siz hatta yarılanma kırk sekiz saati aşar. Altı–dört fotoürünleri olağan hücrede bir saat içinde neredeyse tükenir. Adar'ın ekibinin 2016 PNAS makalesi de altı–dört onarımının büyük kısmının dört saatte bittiğini, dimer onarımının yirmi dört saatte sürdüğünü ve kırk sekizinci saatte hâlâ görüldüğünü yazar.

Yüzdeleri saate çevirmek

Kalan yüzde sabit bir hızla eksiliyorsa kalan = e^(−kt), yarı ömür ln2 ÷ k olur. Olağan hücrenin dimeri için dördüncü saat k = −ln 0,72 ÷ 4 ≈ 0,082 / saat verir; ln2 ÷ 0,082 ≈ 8,4 saatlik bir yarı ömür. Altı–dört için birinci saat k = −ln 0,40 ≈ 0,92 / saat, yarı ömür yaklaşık 0,76 saat: 8,4 ÷ 0,76 ≈ 11 kat fark. Yirmi dördüncü saatin dimer değerinden hesap 13,8 saat çıkar; eğri zamanla yavaşlıyor, tek bir hız yetmiyor. XPC'siz hatta altı–dört için −ln 0,45 ÷ 24 ≈ 0,033 / saat, yarı ömür yaklaşık 21 saat.

Uzunluk da sayılabilir. Çarşamba küvetteki kurgu sayım genom ölçeğine çevrilince 1,07 × 10⁶ dimer etmişti. Her biri bir kesim çifti isterse 2,1 × 10⁶ kesim gerekir; parça başına 24 ile 32 nükleotit, 2,6 × 10⁷ ile 3,4 × 10⁷ yeniden yazılmış nükleotit eder, 1,24 × 10¹⁰'luk paydanın binde 2 ile 3'ü. Cumanın kısa yaması tek nükleotitti; burada her onarımın yaması 24 ÷ 1 ile 32 ÷ 1 arasında, yirmi dört ila otuz iki katı uzunlukta. Bakterinin 12–13 nükleotitlik parçası insanınkinin yaklaşık yarısıdır.

Modelin sınırı

• Kalan yüzde antikor sinyalidir. Lindsey-Boltz'un ekibi geç saatlerde bölünmenin sinyali seyrelttiğini ve hücre ölümünün ölçümü karıştırdığını kendisi not eder; yirmi dördüncü saatin sayısı yalnız onarımı yansıtmaz.
• Tek üstel model tutmuyor. Bee'nin ekibi dimerlerin daha çok nükleozomların içinde, altı–dört ürünlerinin çoğunlukla nükleozomlar arasındaki bağlantı DNA'sında oluştuğunu yazar; erişilebilirlik hasardan hasara değişir.
• Hatlar kültürdeki fibroblastlardır. Derideki çok katmanlı dokuda bölünme durumu hücreden hücreye farklıdır; polimeraz ile ligaz seçimi de, Schärer'in aktardığı gibi, bu duruma göre kayar.
• XPC'nin hasarı dolaylı tanıması ve XPD ile XPA'nın doğrulaması saflaştırılmış sistemlerden kurulmuş bir modeldir; Kusakabe'nin derlemesi onu "önerilen" model diye sunar.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Deriye sürülünce DNA onarımını üstlendiği ya da "onarım enzimi taşıdığı" söylenen ürünlerin, burada izlenen basamakların herhangi birini değiştirdiğini gösteren bir ölçüm yok.
• Kseroderma pigmentozum ve Cockayne sendromu yalnız hücre deneylerinin kaynağı olarak anıldı; bu tabloların kalıtımı ve kanserle ilişkisi modülün kanser dersinin ve kalıtsal kanser sendromları dersinin konusu olacak.

Küvet soğurken

Zelal çizelgenin dibine üç satır not düşüyor: "8,4 ÷ 0,76 ≈ 11"; "24–32 ÷ 1"; "XPC'siz: genom durdu, okunan zincir yürüdü". Küvetin satırını kırmızıyla çerçeveliyor: hiç değişmeyen tek sıra.

Hamiyet Hanım lambayı söndürüyor. "Bugün hasarı bükülmesinden yakaladık," diyor. "Çarşamba sarmalı bükmeyen bir hatayla uğraşacağız."

Kendini sına

1. Küvetteki DNA'nın yüzdeleri neden hiç düşmüyor? Bu satır çizelgenin geri kalanını okumak için neden gerekli?
2. XPC'siz hatta etkin genin okunan zincirinde dördüncü saatte yüzde 34 kalmış. Bu sayı hangi dalın çalıştığını gösterir?
3. CSB'siz hatta genomun tamamındaki dimer onarımı neden olağana yakın, okunan zincirin üstünlüğü neden kayboluyor?
4. Olağan hücrede dimer için yarı ömrü dördüncü ve yirmi dördüncü saatlerden ayrı hesapladığında iki sonuç çıkıyor. Bu fark hakkında hangi iki açıklamayı öne sürebilirsin?
5. Bir hücrede 5 × 10⁵ dimer onarılsa ve her parça 30 nükleotit olsa, yeniden yazılan nükleotitler 1,24 × 10¹⁰'luk paydanın kaçta birini tutar?

Bir sonraki derse köprü

Sarmalı bükmek bugünün hasarlarını ele vermişti; tanıyıcılar o bükülmeyi aradı. Kopyalamadan kalan bir G:T çiftinde ise iki baz da sağlamdır ve bozulma küçüktür. Replikasyon hata düzeltmesinde yönünü yeni zincirdeki çentiklerden aldığını gördüğümüz sistemin tanıyıcısına Yanlış Eşleşme Onarımı dersi bakacak: MutS benzeri proteinler yanlış eşi ve küçük ilmekleri nasıl yoklar, yeni zincir hangi uzunlukta sökülür, mikrosatellit denen tekrarlı diziler bu sistem eksildiğinde neden ilk kayan yerdir?