Endojen DNA Hasarı

Buzdaki tüp, bloktaki tüp

Nisanın ilk pazartesisi. Mardin'de üniversitenin genetik toksikoloji laboratuvarının penceresi ovaya bakıyor; sabah serinliği taş duvarlardan henüz çekilmemiş. Zelal geçen pazartesi saflaştırılmış dana timüsü DNA'sını nötr bir tampona çözmüş, aynı çözeltiyi iki tüpe bölmüş: birini buz kovasına, ötekini 37 dereceye ayarlı ısıtıcı bloğa koymuş. Tüplerde hücre yok, enzim yok, ışık görmemişler.

Hamiyet Hanım bu sabah iki tüpten örnekleri aldehit tutan bir probla işaretleyip zara emdirmiş. Sayım çizelgesi masada: başlangıçta milyon nükleotit başına 2,0 abazik bölge, buzdaki tüpte bir hafta sonra 2,1, bloktaki tüpte 12,6. Yanındaki iki petri kabında olağan bir bakteri suşu ile urasil kesen enzimi olmayan bir suş, raportör geni onaran geri dönüşleri seçen besiyerine yayılmış. Olağan suşun kabında 3, enzimsiz suşunkinde 88 koloni sayılmış.

"Bloğa dışarıdan bir şey girmedi," diyor Zelal. "Yine de bir haftada beş kattan fazla arttı. Bu hasarı kim yaptı?"

Tezgâhtaki sorular

Kopyalama modülünü bir hücre hattında aksayan basamağı arayarak kapatmıştık; o hatta yükü çatalın kendisi üretiyordu. Bu kez kopyalama işin içinde değil. Su, oksijen ve hücrenin kendi metil vericisi DNA'yı nasıl değiştirir? Bu değişikliklerden hangisi kopyalandığında kalıcı bir harfe dönüşür, hangisi geride yalnız bir boşluk bırakır? Sayılar neden birbirini tutmuyor?

Metin

Su bazı koparınca

Tomas Lindahl Nobel konuşmasında, saflaştırdığı RNA'nın kendiliğinden bozunduğunu gördükten sonra aynı soruyu DNA'ya sorduğunu anlatır. Laboratuvar asistanı Barbro Nyberg ile radyoaktif işaretli bakteri DNA'sını nötr tamponlarda günlerce bekletip kromatografiyle inceledi. En belirgin değişiklik guanin ve adeninin, yani pürinlerin zincirden düşmesiydi. Sonuçları 1972'de Biochemistry dergisinde yayımladılar.

Lindahl'a göre guanin ya da adenin kaybından doğan abazik bölgeler kimyasal olarak aynıdır; giden bazın ne olduğunu ancak karşı zincir söyler. Wikipedia'nın abazik bölge maddesi, pirimidinlerin aynı yolla yaklaşık yirmi kat daha yavaş koptuğunu yazar.

Zelal'in çizelgesini mümkün kılan yöntemi Nakamura'nın ekibi 1998'de Cancer Research'te anlattı. Aldehit tutan prob, açık zincir biçimindeki abazik bölgenin aldehitine bağlanıyor ve on milyon bazda iki üç bölgeyi bile seçebiliyor. Ekip dana timüsü DNA'sını fizyolojik koşulda bekletti ve günde milyon nükleotit başına 1,54 yeni bölge ölçtü. Bloktaki tüpün hızı buna yakın: (12,6 − 2,0) ÷ 7 ≈ 1,5. Buzdaki tüpte sayı neredeyse kımıldamamış, çünkü kopma sıcaklıkla hızlanan bir tepkimedir.

Hücre başına kaç eder? Nakamura ekibi aynı ölçümü hücre başına günde yaklaşık 9.000 bölgeye çevirir. İki takım kromozomdaki nükleotitlerin hepsi, iki zincir birlikte, 1,24 × 10¹⁰ eder; 1,54 × 10⁻⁶ × 1,24 × 10¹⁰ ≈ 19.000. Ekibin sayısı ise 9.000 ÷ 1,54 × 10⁻⁶ ≈ 5,8 × 10⁹ nükleotitlik bir paydaya karşılık gelir, aşağı yukarı tek bir genom takımına. Aradaki iki kat fark ölçümden değil, neyin bölen alındığından gelir. Wikipedia'nın kendiliğinden DNA hasarı maddesi farklı yazarlardan gelen memeli tahminlerini derler: depürinasyon için günde 2.000 ile 14.000 arası.

Tek bir nükleotit için hız çok düşüktür: aynı orandan türetilen yarı ömür ln 2 ÷ 1,54 × 10⁻⁶ ≈ 450.000 gün, 1.200 yılı aşar. Binler, on milyarı aşan nükleotitin toplamından gelir.

Kopyalama sırasında abazik bölgenin karşısına okunacak bir harf yoktur. Aynı madde bakteride polimerazın bu boşluğun karşısına çoğunlukla adenin koyduğunu, memelide tablonun canlıya ve deney koşuluna göre değiştiğini aktarır.

Amino grubu sökülünce

Lindahl'ın ikinci büyük bulgusu sitozinin amino grubunu suya kaptırıp urasile dönmesiydi. Konuşmasında bunun DNA'nın kodlama özgüllüğünü değiştirdiğini, yani bir mutasyon olduğunu söyler.

Nükleotitler dersinde urasilin RNA'nın harfi olduğunu görmüştük. DNA'da urasil adeninle eşleşir. Onarılmadan kopyalanırsa bir sonraki kuşakta orada bir A–T çifti durur; G–C çifti A–T'ye dönmüştür. Bir pirimidinin yerine yine bir pirimidin geçtiği için bu değişime geçiş (transition) denir. Lindahl transkripsiyonu etkin, bölünen bir memeli hücresinde sitozin ve 5-metilsitozin deaminasyonlarının toplamını günde yaklaşık 300 olarak verir. Wikipedia'nın derlemesindeki tahmin günde 192'dir. Sayı küçük, ama doğrudan yanlış harf yazan türden.

Çift sarmal burada koruma sağlar. Lindahl'a göre tek zincirli DNA sitozin deaminasyonuna çift zincirliden 150 kat duyarlıdır; depürinasyonda fark yalnız üç dört kattır. Kopyalanan ya da okunan, yani zincirleri geçici olarak ayrılmış bölgeler bu yüzden daha korunaksızdır.

Zelal'in kapları bu harfin hücrede ne yaptığını gösteriyor: 88 ÷ 3 ≈ 29. Duncan ile Weiss 1982'de urasil kesen enzimden yoksun bakterilerde G:C → A:T geçişlerinin yaklaşık otuz kat arttığını, öteki baz değişikliklerinin ise etkilenmediğini buldu. Enzim yalnız deamine sitozinin bıraktığı izi temizliyordu. Bu enzimin bir sonraki adımı nasıl başlattığını Baz Eksizyon Onarımı dersi işleyecek.

Metilli sitozinin sessiz dönüşümü

Memeli genomunda C'nin hemen ardından G gelen yerlerdeki sitozinlerin çoğu bir metil grubu taşır. Bu işaretin gen ifadesindeki rolü epigenetik modülünde açılacak; burada önemli olan kimyasıdır. 5-metilsitozin amino grubunu yitirince urasil değil timin olur. Wikipedia'nın 5-metilsitozin maddesine göre urasil DNA'ya yabancıdır ve tanınır, timin ise olağan harftir. Geriye bir G:T yanlış eşi kalır; kopyalama onarımdan önce gelirse C'nin yerine kalıcı bir T yazılır.

Genom bu kaybın izini taşır. Wikipedia'nın CpG maddesi hesabı yüzde 42 GC içeren bir genom için yapar: CG ikilisinin rastgele beklenen sıklığı 0,21 × 0,21 ≈ 0,044'tür. Saxonov, Berg ve Brutlag 2006'da insan genomunda CpG'nin GC içeriğinin öngördüğünün yaklaşık dörtte biri sıklıkta bulunduğunu, Wikipedia ise beşte birinden az bulunduğunu yazar. İkisi de açığı aynı kimyaya bağlar: evrimsel zamanda timine dönen sitozinler beklenen ikililerin büyük bölümünü silmiştir.

Oksijenin guanine bıraktığı iz

Reaktif oksijen türlerini, hidroksil radikalinin difüzyonun sınırladığı tavan hızda tepkimeye girdiğini ve demirin peroksitten bu radikali ürettiği Fenton tepkimesini oksijenin elektronlarını izlediğimiz derste görmüştük. Lindahl bu türlerin DNA'da yol açtığı özellikle sinsi bir hasar olarak guaninin yükseltgenmesini anar.

Shibutani, Takeshita ve Grollman 1991'de Nature'da polimerazların 8-oksoguaninin karşısına seçici olarak sitozin ya da adenin koyduğunu ve adeninden sonra zinciri sorunsuz uzattığını gösterdi; oran polimerazdan polimeraza değişiyordu. Cheng'in ekibi 1992'de kalıptaki 8-oksoguaninin yol açtığı 23 mutasyonun 22'sinin G → T olduğunu buldu. Bir kopyalamada karşıya A girer, sonrakinde o A'nın karşısına T yazılır. G:C çifti T:A'ya dönmüştür. Bu kez bir pürin bir pirimidinin yerine geçtiği için değişime transversiyon denir.

Günde kaç tane olduğu en tartışmalı sayıdır. Wikipedia'nın derlediği insan tahminleri hücre başına günde 2.800 ile 11.500 arasında dağılır ve çoğu idrara atılan onarım ürünlerinden geriye doğru hesaplanmıştır. Helbock'un ekibi 1998'de DNA'yı ayrıştırma yöntemini değiştirince sıçan dokusundaki kararlı durum düzeyinin bir mertebe düştüğünü gösterdi; ayrıştırma sırasındaki yapay yükseltgenme ölçümü şişirebiliyordu. Bu, bir araştırma ölçütünün yöntem sorunudur; kişiye uygulanacak bir test değildir.

Hücrenin kendi metil vericisi

Rydberg ile Lindahl 1982'de, hücrenin metil vericisi S-adenozilmetiyoninin nötr suda DNA'yı enzimsiz metileyerek az miktarda 7-metilguanin ile 3-metiladenin oluşturduğunu gösterdi: zayıf ama hücrede hep bulunan bir alkilleyici. Lindahl Nobel konuşmasında bu metilasyonun hedeflerinin su ve oksijenin hedeflerinden farklı olduğunu vurgular. Ona göre bazı metillenmiş bazlar kopyalamayı durdurabilir; bu ürünleri gideren onarım düzenekleri sonraki derslerde ele alınacak.

Listeye bir de tek zincir kırıkları eklenir. Chatterjee ile Walker'ın derlemesi memeli hücresinde saatte yaklaşık 2.300 kırık tahminini aktarır; 2.300 × 24 = 55.200, Wikipedia'nın günlük tablosundaki sayının ta kendisidir. Kırıklar sayılan en kalabalık hasardır, ama bir kırık omurgayı keser, harfi değiştirmez.

Sayılar neden tutmuyor

Lindahl çift sarmal için memeli hücresinde günde 10 ile 20 bin değişiklik verir. Wikipedia'nın onarım maddesi on binler mertebesini aynı biçimde aktarır, Lodish'in kitabını kaynak göstererek üst sınırı bir milyona dek çeker. Farkı açıklayan etkenler kaynakların kendi tanımlarında saklıdır: kırıkların sayılıp sayılmadığı, dış etkenlerin işe katılıp katılmadığı, paydaya tek ya da çift genom takımının yazılması ve yükseltgenme ölçümündeki yöntem payı. Üst uç kaynağa göre oynar; on binler mertebesindeki alt uç ise hepsinde ortaktır.

Bu mertebeyi kopyalama hatasıyla karşılaştırınca onarımın yükü ortaya çıkar. 10.000 ÷ 6,2 × 10⁹ ≈ 1,6 × 10⁻⁶; her gün baz çifti başına milyonda 1,6 ile 3,2 arası hasar düşer. Replikasyon hata düzeltmesini işlediğimiz derste süzgeçlerin hepsinden sonra bölünme başına kalan hatayı 0,6 dolayında hesaplamıştık. 10.000 ÷ 0,6 ≈ 17.000; yalnız deaminasyonlar bile 300 ÷ 0,6 = 500 kat daha kalabalıktır.

Harflerin bıraktığı imza

Her hasar kopyalamada kendine özgü bir harf değişikliği yazdığı için genomda bir desen birikir. Sitozin deaminasyonu G:C → A:T, metilli sitozin özellikle CpG'de C → T, 8-oksoguanin G:C → T:A bırakır.

Alexandrov'un ekibi 2015'te 36 kanser türünden 10.250 genomu taradı. NpCpG bağlamında C → T'nin baskın olduğu imza 1, 36 türün 17'sinde kişinin yaşıyla birlikte artıyordu ve yazarlar bunu 5-metilsitozin deaminasyonuna bağladı. COSMIC kataloğu aynı imzayı SBS1 adıyla tanımlar; olağan hücrelerde de yaşla biriktiğini, dokular arasındaki hız farklarının da hücre bölünme hızına uyduğunu, bu yüzden bir bölünme saati olabileceğini yazar. Aynı katalog SBS18 adlı, C → A ağırlıklı bir imzanın olası kökeni olarak reaktif oksijen hasarını gösterir ve bunu "olası" diye işaretler.

Bu kimyayı "durduran" takviyelerin vaadine dönmeye gerek yok; antioksidan takviyesinin mantığını tartıştığımız derste kanıt o yükü taşımamıştı. Kanser genomlarında imzaların nasıl ayrıştırıldığı ve onarım kusurlarının imzayı nasıl değiştirdiği bu modülün kanser dersine kalıyor.

Blok soğurken

Zelal çizelgenin kenarına notlarını geçiriyor: "(12,6 − 2,0) ÷ 7 ≈ 1,5"; "1,54 × 10⁻⁶ × 1,24 × 10¹⁰ ≈ 19.000, payda değişince 9.000"; "88 ÷ 3 ≈ 29"; "10.000 ÷ 0,6 ≈ 17.000". Altına üç ok çiziyor: C → U, 5mC → T, G → 8-oksoG ve her okun ucuna kopyalamadan sonra kalan harfi yazıyor.

Hamiyet Hanım bloğu kapatıyor. "Bu tüplere ne güneş değdi ne duman," diyor. "Çarşamba kapıyı dışarıya açacağız."

Kendini sına

1. Bir tüpte başlangıçta milyon nükleotit başına 1,8 abazik bölge varken on gün sonra 17,2 sayılıyorsa günlük hız nedir? Nakamura ekibinin ölçümüyle karşılaştır.
2. Nakamura ekibinin günlük oranını tek bir genom takımı (3,1 × 10⁹ baz çifti, iki zincir) üzerinden hesaplarsan kaç abazik bölge bulursun? Ekibin 9.000'iyle karşılaştır.
3. Urasil kesen enzimi olmayan bakteride neden yalnız G:C → A:T geçişleri artar, öteki değişiklikler artmaz?
4. 5-metilsitozinin deaminasyonu neden sitozininkinden daha kalıcı bir iz bırakır?
5. 8-oksoguaninin karşısına adenin giren bir zincir iki kez kopyalanınca orijinal G:C çifti hangi çifte dönüşür? Bu değişikliğin geçiş değil transversiyon sayılmasının nedeni ne?

Bir sonraki derse köprü

Saydığımız hasarların hepsi hücrenin kendi suyundan, oksijeninden ve metil vericisinden geldi. Çevresel Mutajenler dersi dışarıdan gelen etkenlere bakacak: ışık, duman ya da besindeki bir toksin DNA'ya hangi kimyasal değişikliği bırakır? Bir çevresel mutajenin genomdaki izi, yaşla biriken iç kaynaklı imzalardan nasıl ayırt edilir?