Telomeraz

Basamakları sayılan şerit

Çarşamba. Lodos gece dönmüş, sabah tepelere ince bir kar yeniden serpilmiş. Feriha Hanım iki jel fotoğrafını ve bir dizileme çıktısını ışıklı masaya yayıyor.

Ekin dün kültürdeki bir kanser hücre hattından özüt hazırlayıp dört tüpe bölmüştü: işlenmemiş özüt, RNazla bekletilmiş özüt, on dakika ısıtılmış özüt ve özüt yerine yalnız tampon. Her tüpe telomerazın tutunabildiği bir başlangıç dizisi ve dört dNTP koymuş, yarım saat beklemiş, sonra ürünleri çoğaltıp jele yüklemiş. İşlenmemiş özütün şeridinde aşağıdan yukarı eşit aralıklarla tırmanan bir merdiven var. RNazlı ve ısıtılmış şeritlerde merdiven yok; bu iki şeritte ve tamponda yalnız her tüpe konan denetim parçasının tek bandı yanıyor. Ekin cetvelle ölçmüş: birinci basamakla onuncu basamak arası 54 baz çifti.

İkinci jelde arıtılmış TERT proteini iki ayrı RNA ile birleştirilmiş: biri olağan, öbüründe kalıbın yazılan kısmındaki tek bir harf değiştirilmiş. İki enzim de bir telomer başlangıç parçasını altı nükleotitlik basamaklarla uzatmış. Fark dizilemede çıkmış: değiştirilmiş RNA'lı enzimin eklediği otuz tekrarın her birinde aynı konumda aynı yabancı harf duruyor.

"Basamak aralığı değişmemiş, harf değişmiş," diyor Ekin. "Harfi kalıptan okuduğu belli. Peki bir harfi yanlış koyduğunda geri dönüp silebiliyor mu?"

Mekanizma

Kalıbı içinde taşıyan polimeraz

Kromozom uçlarını tanıdığımız derste telomerazın TERT proteini ile TERC adlı RNA'dan kurulduğunu, Blackburn'ün laboratuvarında Greider'in Tetrahymena özütünde TTGGGG ekleyen bir etkinlik bulduğunu görmüştük. Pazartesi bütün polimerazlar DNA'dan okuyordu. Telomeraz ise okuduğu kalıbı yanında taşır ve o kalıp RNA'dır.

Wu ile arkadaşlarının 2017 derlemesi telomerazı bu ailede ayrı bir yere koyar: retrovirüs enzimi dışarıdan gelen bir RNA'yı baştan sona okur, telomeraz her seferinde aynı iç kalıbı yeniden kullanır. Greider'le Blackburn'ün 1987 tarihli özetine ve Nobel bültenine göre etkinlik hem RNA'ya hem proteine muhtaçtı. 1989'da enzimin RNA'sı klonlandı; o yılın özetine ve Wikipedia'daki Greider maddesine göre içinde TTGGGG tekrarına eş CAACCCCAA dizisi vardı. Aynı yıl Morin HeLa hücrelerinin özütünde TTAGGG ekleyen insan enzimini buldu; Wu ekibi de insanda ilk saptamayı bu hücre hattına bağlar.

Ekin'in RNazlı şeridi bu yüzden boş: özütteki RNA yıkılınca enzim kalıbını yitirir. Isıtılmış şerit proteinin bozulduğunu gösterir; 1985 özeti de etkinliğin ısıya ve proteinaz K'ya duyarlı olduğunu yazar.

Altı harf, bir kayma

Wikipedia'daki telomeraz yazısı insan RNA'sındaki kalıbı 3'-CAAUCCCAAUC-5' diye verir. Kalıba harf harf eş yazınca 5'-GTTAGGGTTAG-3' çıkar. İlk beş harf, GTTAG, kromozom ucunun zaten taşıdığı son harflerdir ve kalıbın 3' tarafıyla eşleşerek enzimi yerine oturtur; Nguyen'in 2021 derlemesi bu kısma hizalama bölgesi (alignment region) der. Geri kalan 11 − 5 = 6 harf yeni yazılır: GGTTAG, yani TTAGGG'nin kaydırılmış bir okunuşu.

Kalıbın ucuna varınca ne olur? Nguyen'e ve Wu ekibine göre sentez kalıbın 5' sınırında durur, yeni DNA ile kalıp arasındaki kısa sarmal açılır, ürün enzimden kopmadan kayar ve yeni 3' ucu kalıbın başındaki hizalama harfleriyle yeniden eşleşir. Sonra ikinci tur başlar; ansiklopedi yazısı da döngüyü bırakıp yeniden hizalama diye özetler.

Schmidt ile Cech'in 2015 derlemesi terimi Greider'in 1991 çalışmasına bağlar. O çalışmanın özeti merdivenin kaynağını da verir: ürünlerin karakteristik altı nükleotitlik bant deseni, kalıbın sonuna varılınca bir kayma basamağının bulunmasını gerektiriyordu. Basamaklar ürünün kayma sırasında takılıp kaldığı ya da enzimden düştüğü boylardır; aralarındaki uzaklık bir tekrarın boyudur. Morin'in özütü de altı nükleotitlik bir desen vermişti. Ekin'in cetveli aynı şeyi söylüyor: dokuz aralık 54 baz çifti eder, 54 ÷ 9 = 6.

Merdiveni görünür kılmak

Hücredeki az miktar telomerazın ürününü görmek için 1994'te Kim ve arkadaşları duyarlı bir ölçüm geliştirdi; Wikipedia yöntemi Geron şirketindeki bu ekibe bağlar.

Mender ile Shay'in 2015 yöntem yazısı ve Kuriakose ile Xiao'nun 2024 protokolü basamakları aynı sırayla verir: oda sıcaklığında uzatma, telomerazı bozan bir ısıtma, ardından PCR. Isıyla bozulmuş özüt, yalnız tampon ve su olumsuz denetimlerdir. Her tüpe 36 baz çiftlik bir iç standart da konur. Telomerazın uzatmadığı bu parça her tüpte çoğalır; görünmüyorsa PCR aksamıştır ve boş şerit yanıltır. Ekin'in tampon şeridindeki tek bant budur.

Silme alanı olmayan bir yazıcı

Pazartesi Pol δ'nın ve Pol ε'nin 3'→5' silme alanını, katmanların çarpımını işlemiştik. Schmidt ile Cech'in ve Nguyen'in derlemeleri insan TERT'ini ucu tutmaya ve çağrılmaya katılan TEN alanı, RNA'yı bağlayan alan, ters transkriptaz alanı ve C-uç uzantısından kurar; bu listede ayrı bir silme alanı geçmez.

Doğruluk o hâlde kalıbın kendisinden gelir. Wu ekibine göre kopyalanan bölgenin sınırları kesin çizilmiştir ve her tur aynı altı harfi okur. Okuma yine de hatasız sayılmaz. Kreiter ve arkadaşlarının 1995 özeti tüpte kurulan insan telomerazında nükleotit başına yaklaşık 2 × 10⁻³ hata ölçer, yüz tekrarda bir kurala uymayan tekrar; Drosopoulos ile Prasad aynı tahmini aktarır. Altı harflik bir tekrar için bu 0,012 eder (6 × 0,002), aşağı yukarı 83 tekrarda bir yanlış. Pazartesinin sayılarıyla oranlarsak 2 × 10⁻³ ÷ 10⁻⁴ = 20: silme alanından yoksun Pol α'nın tüpteki hatasından yirmi kat sık. Bütün süzgeçlerden geçmiş 10⁻¹⁰ ile oran 2 × 10⁷'dir.

Ekin'in otuz tekrarı bu yüzden rastgele hata olamaz. Bu hızla otuz tekrarın 180 harfinde kendiliğinden beklenen yanlış 180 × 0,002 ≈ 0,36'dır; otuzun otuzunda aynı yerde aynı harf kalıbın imzasıdır.

Drosopoulos ile Prasad bir ipucu daha verir: etkin bölgedeki bir valini başka amino asitlerle değiştirince enzim yavaşladı, doğruluğu ise arttı. Yazarlar insan enziminin hızlı tekrar sentezi uğruna doğruluğun bir kısmından vazgeçmiş olabileceğini önerir.

Silmeye benzeyen bir etkinlik yine de görüldü. Collins ile Greider 1993'te Tetrahymena telomerazının başlangıç parçasının 3' ucundaki, kalıba uymayan harfleri kesip ardından uzattığını buldu. Oulton ile Harrington 2004'te insan telomerazıyla birlikte arınan benzer bir kesme etkinliği bildirdi ve bu etkinliğin düzeltmeye, süreçliliğe ya da ikisine birden yaradığının düşünüldüğünü yazdı. Ekin'e verilecek karşılık temkinli: telomerazda Pol δ'daki gibi bir silme alanı yok, tüpte görülen kesmenin canlıda düzeltme okuması yapıp yapmadığı ise henüz sınanmamış.

Uca çağrılmak

Telomeraz uca rastgele çarparak varmaz. Schmidt ile Cech, Wikipedia'nın TERC ve Cajal cisimciği maddeleri aynı yolu anlatır: RNA'nın 3' ucundaki kısa CAB kutusu TCAB1 proteinine bağlanır ve enzim çekirdekteki zarsız küçük yapılara, Cajal cisimciklerine toplanır. Schmidt ile Cech'e göre enzim telomerlere yalnız S evresinde çağrılır; Lim ile Cech'in 2021 derlemesi de çağrıyı bu evreye yerleştirir.

Çağıran shelterin'in bir üyesidir; bu kompleksin TRF1, TRF2 ve POT1 üyelerini uçlarla birlikte tanımıştık. TPP1 adlı üyenin yüzeyinde glutamat ve lösince zengin küçük bir yama, TEL yaması, TERT'in TEN alanına tutunur. Lim ile Cech'e, Schmidt ile Cech'e ve ACD genine ayrılmış Wikipedia yazısına göre bu temas enzimi uca getirir ve tekrar ekleme süreçliliğini artırır; yama bozulunca telomeraz uca ulaşamaz.

Ne zaman durur

Lim ile Cech insan telomerazının hücre döngüsü başına bir telomere yaklaşık altmış nükleotit eklediğini yazar; Schmidt ile Cech bir başlatmada eklenen miktarı 50 ile 60 nükleotit verir. 60 ÷ 6 = 10 tekrar. Uç neden durmadan uzamaz?

Marcand'ın ekibi 1997'de mayada bir telomere bağlanan Rap1 proteinini yapay olarak çoğalttı ve ucun bağlanan molekül sayısıyla orantılı kısaldığını gördü. Levy ile Blackburn 2004'te sayılanın Rap1'in yanına çektiği Rif proteinleri olduğunu gösterdi. İnsanda van Steensel ile de Lange 1997'de TRF1 fazlasının telomerleri adım adım kısalttığını, TRF1'in bağlanmasını engelleyen bir mutantın ise uzattığını bildirdi. Smogorzewska ekibi TRF1 ile TRF2'nin uzun telomerlerde daha bol bulunduğunu gözledi. Srinivas ekibi bu bulguları protein sayma modeli diye toplar: uç uzadıkça daha çok protein bağlanır ve telomerazı uzaktan frenler, kısa uçlar öncelikle uzatılır. Wikipedia'nın TERT maddesi de enzimin kısa telomerleri yeğlediğini yazar.

Schmidt ile Cech'e ve Lim ile Cech'e göre bir fren daha var: CST kompleksi uzayan tek zincirli uca bağlanıp telomerazı uzaklaştırır, sonra karşı zincirin doldurulması için Pol α–primazı uca çağırır. Telomerazı olmayan bazı tümörler ise uçlarını başka bir yolla korur; Wikipedia ve Srinivas ekibi bunu rekombinasyona dayanan alternatif telomer uzatması (ALT) diye adlandırır.

Modelin sınırı

• Kalıp ve kayma döngüsünün ayrıntıları çoğunlukla tüpte kurulan enzimden ve donmuş yapılardan geliyor. Nguyen hizalama ve sonlanma basamaklarında çizilen eşleşmelerin varsayımsal olduğunu not eder; Wu ekibi döngünün sonunda kalıp ile ürün arasında kaç baz çifti kaldığının çözülmediğini yazar.
• Hata oranı tek ve eski bir tüp ölçümüne dayanıyor; hücredeki telomer tekrarlarında görülen sapmaların ne kadarının telomerazdan geldiği bu kaynaklarda ölçülmüyor.
• Kesme etkinliğinin TERT'in kendisine mi, ona eşlik eden bir proteine mi ait olduğu bu kaynaklarda gösterilmiyor.
• Sayma modeli mayada doğrudan sınandı; insanda ilmeğin, protein sayısının ve CST'nin frendeki payları birbirinden ayrılamadı.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Telomerazın parçalarını, olgunlaşmasını ya da uca taşınmasını bozan kalıtsal değişikliklerle ilişkili hastalıklar ve telomerazın kanserdeki yeri, hücresel yaşlanma ve kanser biyolojisine ayrılan modüllerde ele alınacak.

Jeller panoya

Ekin iki jel fotoğrafını panoya, pazartesinin plaka fotoğraflarının altına iğneliyor ve kenarlarına yazıyor: "54 ÷ 9 = 6", "60 ÷ 6 = 10 tekrar", "2 × 10⁻³ ÷ 10⁻⁴ = 20". Dizileme çıktısındaki otuz yabancı harfi kırmızı kalemle tek tek daire içine alıyor.

Feriha Hanım panoya geri çekilip bakıyor: çarşambanın camları, cumanın boncuğu, beş şeritlik jel, bağcıklar, sayım çıktısı, plakalar, şimdi de merdiven. "Kopyalamayı başından sonuna kadar söktük," diyor. "Cuma bir hastanın dosyasını açacağız. Hangi basamağın bozulduğunu sen bulacaksın."

Kendini sına

1. Telomer tekrarı TTGGGG olan bir siliyatta TRAP merdiveninde basamak aralığı kaç baz çifti olur? Birinci ile on beşinci basamak arası ne kadar eder?
2. RNazlı şeritte merdiven yok ama 36 baz çiftlik iç standart da görünmüyorsa sonucu nasıl yorumlardın?
3. Döngü başına altmış nükleotit ve nükleotit başına 2 × 10⁻³ hatayla kaç uzatmada bir yanlış harf beklenir?
4. TPP1'in TEL yaması bozuk bir hücrenin özütü TRAP'ta neden olağan bir merdiven verebilir? Telomerleri yine de neden kısalır?
5. Değiştirilen harf yazılan kısımda değil de hizalama bölgesinde olsaydı, enzim ikinci tura geçerken neden zorlanabilirdi?

Bir sonraki derse köprü

Telomerazın kalıbını nasıl okuyup kaydığını, etkinliğinin nasıl ölçüldüğünü, hatasına ne olduğunu ve uca nasıl çağrılıp durdurulduğunu gördük. Replikasyon Bozuklukları dersi modülü bir vakayla kapatacak: başlangıç noktalarının lisansından uçların uzatılmasına kadar izlediğimiz basamaklardan hangisi bir hastada aksamıştır ve bu aksama hücrede kopyalama hızında mı, hata yükünde mi, uç uzunluğunda mı belirginleşir?