Replikasyon Hata Düzeltmesi

Dört plakada koloniler

Pazartesi; martın dördüncü haftası lodosla açılmış, tepelerdeki kar çekilmeye başlamış. Feriha Hanım ışıklı masanın üstüne dört petri kabı diziyor. Ekin cuma günü dört maya suşunu, bir raportör geni bozulan hücreleri seçen besiyerine yaymıştı.

Birinci suş olağan maya. İkincisinde Pol δ'nın silme alanı, etkin bölgesindeki değişikliklerle çalışmaz hâle getirilmiş. Üçüncüde yanlış eşleşme onarımının bir geni silinmiş. Dördüncüde ikisi birden bozuk. On milyon hücre başına birinci plakada iki koloni, ikincide iki yüz, üçüncüde seksen sayılmış. Dördüncü plakada sayılacak koloni yok: yalnız toplu iğne başı kadar, birkaç bölünmede durmuş hücre kümeleri.

Yanda bir de jel duruyor. Ekin kalıba eşlenmiş bir primerin son, 3' ucundaki nükleotidini bilerek yanlış seçmişti. Silme alanı sağlam Pol δ, dNTP verilmeyen tüpte primeri bir nükleotit kısaltmış; dNTP'li tüpte kalıbın sonuna kadar yazmış. Silme alanı bozuk enzimin ürünü çoğunlukla primer boyunda takılı kalmış, tam boyda yalnız soluk bir bant var.

"Bozuklukların hiçbiri tek başına hücreyi durdurmuyor," diyor Ekin. "İkisi bir araya gelince dördüncü suş neden büyüyemedi?"

Mekanizma

Eşleşmenin kendi payı

Baz eşleşmesini işlediğimiz derste bazların nadir tautomer biçimlerine geçip doğru çiftin biçimini taklit eden yanlış eşler kurabildiğini görmüştük. Eşleşmenin enerjisi bu hatayı ne ölçüde engeller? Kunkel ile Erie'nin 2015 derlemesine göre polimeraz yalnız doğru ve yanlış çift arasındaki serbest enerji farkına yaslanan bir fermuar olsaydı her yüz ile bin eklemeden biri yanlış olurdu. Kunkel'in 2009 değerlendirmesi de çözeltideki bu farkın yaklaşık yüzde bir hataya yettiğini yazar.

Diploit genomun 6,2 × 10⁹ baz çiftini yüzde bir hatayla kopyalayan hücre her bölünmede 6,2 × 10⁷ yanlış harf bırakırdı.

Polimeraz bu payı kendi cebinde büyütür. DNA polimerazları dersinde parmakların doğru nükleotidin üstüne kapandığını ve dar cebe yalnız kurallı çiftin biçiminin uyduğunu görmüştük. Kunkel'e göre yanlış eşler bu cepte çakışır ve bağlanmadan bağ kurmaya her adım yavaşlar. Kunkel'in derlediği ölçümlerde silme alanı olmayan Pol α'da ve silme alanı kapatılmış Pol δ ile Pol ε'de tüpteki hata on binde bir dolayındadır. Schaaper 1993'te bakteride taban seçiminin hatayı iki yüz binde bir ile iki milyonda bir arasına indirdiğini hesapladı.

Geri silmek

Polimerazlar dersinde enzimin bir de silme alanı taşıdığını not edip açılışını bu derse bırakmıştık.

Kunkel'in derlemesiyle Wikipedia'daki polimeraz yazısı aynı sırayı anlatır. Yanlış eşin ardından bir sonraki eklemenin hızı düşer; bu bekleyişte primerin ucu kalıptan ayrılıp açılır ve tek zincir hâlinde polimeraz merkezinden ekzonükleaz merkezine kayar. Orada yanlış nükleotit kesilir, uç geri döner, yazım sürer. Ekin'in jelinde sağlam enzim dNTP yokken yanlış ucu yalnız silmiş, dNTP verilince silip yeniden yazmış; bozuk enzim yanlış ucu uzatmakta zorlanmış.

Bakteride Pol I, Pol II ve Pol III bu yeteneği taşır; Pol III'te silmeyi ayrı bir alt birim, ε yapar. Ökaryotta Wikipedia'nın düzeltme maddesi ve Kunkel'in polimeraz tablosu silme alanını yalnız Pol δ ile Pol ε'ye verir; Pol α'da bu alan etkisizdir. Okazaki parçalarını işlediğimiz derste Pol α ürününün çentik kaydırmayla söküldüğünü görmüştük. Kunkel bir ipucu daha aktarır: Pol α'sı hataya yatkın hâle getirilmiş mayada hata yükü, Pol δ'nın silme alanı da bozulunca keskin biçimde artıyor; Pol δ kendinden önce yazanın hatalarını da okuyor olabilir.

Katkı canlıya ve hatanın türüne göre değişir: Kunkel ortalamayı on ile yüz kat arasında verir; Schaaper bakteride kırk ile iki yüz kat buldu.

Enerjiyle satın alınan seçicilik

Bağlanma enerjisinin izin verdiğinden daha iyi ayırt etmek mümkün mü? Wikipedia'nın kinetik düzeltme ve düzeltme maddeleri soruyu John Hopfield'ın 1974'te, Jacques Ninio'nun 1975'te birbirinden habersiz cevapladığını yazar.

Hopfield'ın özetine göre mekanizma, tepkime örneğin fosfat yıkımıyla güçlü ama ayrım gözetmeden sürüldüğünde işler; DNA kopyalaması da örnekler arasındadır. Kinetik düzeltme maddesi silme alanlı polimerazları bu şemanın bir örneği olarak verir: geri dönüşsüz adım bazın eklenmesi, çıkış da silinmesidir. Bedeli harcanmış nükleotittir. Polimerazlar dersinde her eklemenin iki yüksek enerjili bağa mal olduğunu hesaplamıştık. Kunkel'e göre silmenin ürünü tek fosfatlı bir nükleotittir, yani o iki bağ geri gelmez. Protein triyajını işlediğimiz derste açılmış bir zincirin akıbetini yolların birbirine göre hızlarının belirlediğini izlemiştik; burada da karar, uzamanın hızı ile silmenin hızı arasındaki yarışta veriliyor.

Son süzgeç

Kunkel bu sistem tümüyle kaybolunca nokta mutasyonu hızının yüz ile bin kat arttığını yazar. NobelPrize.org da 2015 Kimya ödülünü Tomas Lindahl ve Aziz Sancar ile paylaşan Paul Modrich'in gösterdiği bu mekanizmanın hata sıklığını yaklaşık bin kat düşürdüğünü söyler.

Onarımın asıl güçlüğü hangi zincire dokunacağıdır: yanlış eşin iki harfinden biri kalıpta, öbürü yeni zincirde. Wikipedia'nın Dam metilaz ve onarım maddelerine göre E. coli GATC dizilerindeki adenini metiller; kopyalamanın hemen ardından yeni zincir henüz metillenmemiştir, DNA yarı metillidir. Onarım kompleksindeki MutH metilsiz zinciri keser. Kunkel ile Erie de yeni zincire yönelimi bu geçici metil eksikliğine bağlar.

Ökaryotta böyle bir işaret bulunmuyor. Kunkel ile Erie'ye ve onarım maddesine göre yön yeni zincirdeki çentiklerden gelir: RFC, PCNA'yı çentiğe tek bir yönde yükler ve yönü belli kelepçe, onarım proteinlerinden MutLα'nın gizli kesme etkinliğini yeni zincir üzerinde çalıştırır. Okazaki parçalarını birleştirmeyi beklerken gördüğümüz çentikler burada bir adres işi görür. Sistemin parçaları ve yeni zincirdeki sökümün ayrıntısı yanlış eşleşme onarımına ayrılan derse kalıyor.

Katmanların çarpımı

Schaaper bakteride, Kunkel ile Erie ökaryotta süzgeçleri art arda dizer. Seçicilik 10⁻⁵, düzeltme okuması yüz kat, onarım yüz kat alınırsa 10⁻⁵ × 10⁻² × 10⁻² = 10⁻⁹ çıkar. Onarım bin kat alınırsa sonuç 10⁻¹⁰ olur. Kunkel ile Erie ökaryot genomunda ölçülen kendiliğinden mutasyon hızını kuşak başına baz çifti başına 10⁻¹⁰ dolayında verir; Phillips ile Milo bakteri için aynı mertebeyi aktarır.

Diploit genomda 6,2 × 10⁹ × 10⁻⁹ ≈ 6 yeni hata eder; 10⁻¹⁰ ile 6,2 × 10⁹ × 10⁻¹⁰ ≈ 0,6. Ölçümler alt uca yakındır: Phillips ile Milo insan germ hattında genom ve kopyalama başına 0,1 ile 1 mutasyon hesaplar, Albertson ekibi mayada bölünme başına birden azını aktarır. Onarım katmanı düşerse 10⁻⁹ tabanında 6 hata 600'e, 10⁻¹⁰ tabanında 0,6 hata 60'a çıkar.

Ekin'in plakaları aynı çarpımı sınıyor. Silme alanı bozuk suşta 200 ÷ 2 = 100 kat, onarımsız suşta 80 ÷ 2 = 40 kat artış var. Katmanlar art arda çalışıyorsa çift bozuk suşun beklenen sıklığı 2 × 100 × 40 = 8.000 koloni, yani on milyonda sekiz bin, 8 × 10⁻⁴'tür. Morrison ekibi 1993'te mayada gerçek ölçümün çarpımsal olduğunu buldu ve iki kusuru birlikte taşıyan haploit hücrelerin birkaç bölünmeden sonra büyümeyi bıraktığını gördü; Morrison ile Sugino 1994'te Pol δ ile Pol ε'nin silme alanlarını birlikte kapatınca haploit maya yine yaşamadı.

Schaaper ile Radman 1989'da bilinen en güçlü mutatör olan E. coli mutD5 suşunu inceledi: Pol III'ün silme alt birimi bozuktu, ama hızlı büyüyen hücrelerde onarım da çalışmıyordu. Onarım bozuk değil, düzeltilmemiş hata bolluğuyla doymuştu. Albertson ekibi farede iki kopyalayıcı polimerazın, ε ile δ'nın, silme alanlarının birbirinden ayrı mutatör ve kanser desenlerini baskıladığını gösterdi.

Doğruluğun bir koşulu da nükleotit havuzudur. Ganai ile Johansson dengeli nükleotit sağlanmasını doğruluğun bileşenleri arasında sayar. Kumar ekibinin 2011 maya çalışmasına ve Kunkel ile Erie'ye göre dengesiz havuz yanlış eklemeyi artırır; bir sonraki doğru nükleotidin yüksek derişimi de yanlış ucu silinmeden uzatır.

Modelin sınırı

• Katman çarpanları ortalamadır. Kunkel ile Erie'ye göre kopyalayıcı polimerazlar bazı yanlış eşleri on milyonda birden seyrek, uzun tek harf dizilerinde bir baz kaybını binde birden sık yapar; tek sayı bu yelpazeyi saklar.
• Hesaptaki 10⁻⁵ ve yüz kat değerleri farklı canlılardan ve deney türlerinden birleştirildi; 10⁻⁹ ile ölçülen 10⁻¹⁰ arasındaki fark bu birleştirmenin payını da taşır.
• Ölçümler maya, bakteri ve germ hattından gelir; bölünen insan doku hücresinde hız farklı olabilir, hasar kaynaklı mutasyonlar hesaba girmez.
• Ökaryotta yeni zincirin tanınması çoğunlukla tüpte kuruldu; canlı hücrede aynı yolla işlediği henüz doğrudan izlenmedi.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Takviyeler ve antioksidan karışımları, DNA hatalarını azalttıkları ya da giderdikleri ileri sürülse de bu süzgeçlerden destek almaz; antioksidan takviyesinin mantığını işlediğimiz derste ölüm ve kanser iddialarının büyük denemelerde tutmadığını görmüştük. Onarım ya da düzeltme alanındaki kalıtsal değişikliklerin kansere yatkınlıkla ilişkisi, onarım modülünde kanser vakalarına ayrılan derste ele alınacak.

Plakalar soğuk odaya

Ekin plakaların kapağına sayıları yazıyor: "10⁻⁵ × 10⁻² × 10⁻² = 10⁻⁹"; "6,2 × 10⁹ × 10⁻⁹ ≈ 6"; "200 ÷ 2 = 100, 80 ÷ 2 = 40, beklenen 8 × 10⁻⁴". Dördüncü plakanın kapağı boş kalıyor.

Feriha Hanım jel fotoğrafını panoya, cumanın sayım çıktısının yanına iğneliyor. "Bugün bütün polimerazlar DNA'yı DNA'dan okudu," diyor. "Çarşamba RNA'sını yanında taşıyıp ondan okuyan bir enzime geçeceğiz. Hatasını silebiliyor mu, onu da soracağız."

Kendini sına

1. Polimeraz seçiciliği 10⁻⁴, düzeltme okuması on kat, onarım bin kat olsaydı toplam hata oranı ne olurdu? Diploit bir hücrede bölünme başına kaç yeni hata beklerdin?
2. Ekin silme alanı bozuk suşta 600, onarımsız suşta 40 koloni saysaydı (olağan suş yine 2), çift bozuk suş için beklenen sıklık ne olurdu?
3. Dam metilazı olmayan bir E. coli'de onarım sistemi yanlış eşi neden kalıp zincirde de onarabilir?
4. Jelde dNTP derişimi on katına çıkarılsaydı sağlam Pol δ'nın tam boy ürünlerinde yanlış harfin payı neden artabilirdi?
5. mutD5 suşu yavaş büyürken onarım neden yeniden çalışır?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste yanlış harfin üç süzgeçte nasıl elendiğini gördük. Telomeraz dersi uçlara dönecek: telomerazın kendi RNA'sındaki kısa kalıbı okuyup her tekrardan sonra nasıl kayarak yeniden hizalandığı, etkinliğinin TRAP deneyiyle nasıl ölçüldüğü, enzimin telomere nasıl çağrıldığı ve uzunluğun nasıl denetlendiği sorulacak. RNA'dan DNA yazan bu ters transkriptazın bir düzeltme okuması var mı, yoksa hatasını başka bir süzgeç mi yakalar?