Okazaki Parçaları

Gradyanın iki tepesi

Cuma sabahı; martın üçüncü haftası bitiyor. Bingöl'e gece ayaz vurmuş, dünkü saçak suyu pencerenin altında buz tutmuş. Feriha Hanım sayım cihazının çıktısını masaya seriyor, Ekin dört sütun grafiği yan yana tutturuyor.

Ekin dün bakteri kültürünü yirmi derecelik su banyosunda soğutmuş, kaplara işaretli timidin verip nabzı soğuk alkaliyle durdurmuştu. Alkali DNA'nın iki zincirini birbirinden ayırıyor; tek zincirler, dipte yoğunlaşan bir şeker çözeltisinin üstüne katman olarak serilip gece boyunca santrifüjlenmiş. Sabah tüpler damla damla bölünmüş, her bölümün radyoaktivitesi sayılmış. Kısa zincirler tüpün tepesine yakın kalıyor, uzunlar dibe iniyor.

On saniyelik nabız verilen birinci kapta sayımın çoğu tepedeki dar bir zirvede. Bir dakikalık nabızda dipteki zirve büyümüş. On saniyelik nabzın ardından iki dakika işaretsiz timidinle kovalanan üçüncü kapta tepe neredeyse boşalmış, sayım dibe geçmiş. Dördüncü kap ligazı ısıyla bozulan bir suştan: nabız ve kovalama aynı, ama sayım tepeden hiç kıpırdamamış.

Masanın kenarında bir de jel fotoğrafı var: ligazı baskılanmış maya hücrelerinden toplanan yeni DNA, aralıkları eşit bir merdiven gibi 165, 330 ve 495 nükleotit dolayında üç basamak vermiş.

"Dördüncü kabı ben de kovaladım," diyor Ekin. "Parçalar orada bekliyor. Neyi bekliyorlar? Mayadakiler neden cetvelle kesilmiş gibi?"

Mekanizma

Saniyelerle yakalamak

Çarşamba geciken zincirin parçalı yazılması gerektiğini kâğıt üstünde ve bağcıklarla kurmuştuk; bu parçaları ilk kez tüpte gören Nagoya'daki ekipti. Tsuneko Okazaki'nin 2017 tarihli anısına ve Wikipedia'daki maddeye göre deneyi Reiji Okazaki'nin ilk doktora öğrencisi Kiwako Sakabe yürüttü. Fujita Tıp Dergisi'ndeki biyografi de anı yazısı da sonuçların 1968'de PNAS'ta yayımlandığını yazar.

Sorun süreydi. Anıya göre 37 derecede yalnız büyüyen uçları işaretlemek için gereken nabız saniyenin onda birinden kısa çıkıyordu. Ekip bakteriyi yirmi derece ya da altına soğutup birkaç saniyelik nabız verdi; anıdaki şekil de Reiji Okazaki'nin Wikipedia maddesi de on saniyeden söz eder. Alkali şeker gradyanında etiketin büyük kısmı bin ile iki bin nükleotitlik kısa zincirlerdeydi. Nabız uzatılınca etiket genomun geri kalanıyla aynı davranan uzun zincirlere geçti; anıya göre etiketsiz timidinle kovalayınca da öyle oldu.

Hesap bu soğutmanın gerekçesini gösterir. Polimerazlar dersinde bakteri çatalının bir saniyede bin nükleotit dolayında ilerlediğini görmüştük. 37 derecede iki saniyelik bir nabız bir çatal kolunda 2 × 1.000 = 2.000 nükleotidi işaretler, yani bir parçanın tamamını. Bin beş yüzlük bir parça 1.500 ÷ 1.000 = 1,5 saniyede biter; on saniyelik bir nabız 37 derecede birkaç parçayı yazıp birleştirmeye yeterdi ve kısa tepe silinirdi. Parçayı görmek için nabız parçanın yazılma süresinden kısa olmalıdır.

Kısa zincirler belki DNA'yı çıkarırken kırılmıştı. Ekip 1967'de bulunan ligazdan yararlandı: kırılma değil de birleştirilmeyi bekleyen ara ürünlerse, ligaz bozulunca birikmeliydiler. Anı yazısına, Wikipedia'ya ve Sugimoto ile Okazaki'lerin 1968 tarihli ikinci makalesinin başlığına göre ligazı yüksek sıcaklıkta bozulan T4 fajlarıyla enfekte bakterilerde kısa yeni zincirler birikti; sıcaklık düşürülünce uzun zincirlere katıldılar. Ekin'in dördüncü kabı buydu.

Neden bu boy

Bakteride parçalar uzundur: anı bin ile iki bin, Balakrishnan ile Bambara'nın 2013 derlemesi yaklaşık bin iki yüz nükleotit verir. 4,6 megabazlık E. coli genomunda iki çatalın geciken kolları toplam 4,6 × 10⁶ nükleotit yazar; 1.500'lük parçalarla 4,6 × 10⁶ ÷ 1.500 ≈ 3.100 parça, iki uçta 2.300 ile 4.600 arası.

Ökaryotta parçalar çok daha kısadır; Wikipedia yüz ile iki yüz nükleotit verir. Balakrishnan ile Bambara bu boyun nükleozom periyoduyla belirlendiğini yazar. Smith ile Whitehouse 2012'de maya ligaz I'ini baskıladı ve biriken parçaları derin dizilemeyle okudu: boylar mayanın 165 baz çiftilik nükleozom tekrarına göre dizilmişti, parça uçları nükleozomların ortasında, histonların DNA'yı en sıkı tuttuğu yerde yoğunlaşıyordu. Ekin'in merdiveni bu deseni taklit ediyor.

Histonlar dersinde CAF-1'in kopyalamada histon dörtlülerini yeni DNA'ya dağıttığını görmüştük. Smith ile Whitehouse, CAF-1'in herhangi bir alt birimini silince periyodun kaybolduğunu ve parçaların ortalamada uzadığını buldu. Yazarların modelinde polimeraz, arkasında hemen kurulan nükleozoma girdikçe zorlanır ve ortasına yaklaşınca bırakır. Sun ve ekibinin 2023 derlemesi de kavşağın yerini histon yerleşimine bağlar; Burgers ile Kunkel, ligazı kapatılan mayada parçaların akış aşağıdaki kromatine çarpana kadar uzadığını aktarır.

Çarşamba hesabı 200 nükleotitlik bir varsayımla kurmuştuk. Geciken kollara düşen 6,2 × 10⁹ nükleotit 165'lik parçalara bölünürse 6,2 × 10⁹ ÷ 165 ≈ 3,8 × 10⁷ parça çıkar; 200 ile 3,1 × 10⁷ bulmuştuk, fark yaklaşık beşte birdir. Wikipedia'nın aralığının alt ucu olan 100 nükleotit sayıyı 6,2 × 10⁷'ye çıkarır.

Primerin sökülmesi

Her parçanın başında bir RNA primer, onun ardında Pol α'nın yazdığı kısa bir DNA vardır. İki derleme, Burgers ile Kunkel'inki ve Martín-Rufo ile Lecona'nınki, aynı adımı anlatır: Pol δ önceki parçanın 5' ucuna varınca durmaz; yazmayı sürdürüp o ucu kalıptan soyar. Soyulan uç tek zincir olarak sarkar.

Burgers ile Kunkel kanadın çoğunlukla tek nükleotitte kaldığını yazar: Pol δ biraz ilerler, FEN1 keser, Pol δ yeniden ilerler. Bu tekrarlanan döngüye çentik kaydırma (nick translation) denir; RNA bitene, çoğu zaman biraz da ötesine dek sürer. Kanat bazen uzar ve tek zincir bağlayan RPA ile kaplanınca FEN1'e direnir. Mayada bu uzun kanatları Dna2 kısaltır, kalanı FEN1 alır; Wikipedia ve Sun ekibi de iki yolu kısa ve uzun kanat yolu diye ayırır.

Pol δ, FEN1 ve ligazın üçünde de PCNA'ya tutunan bir motif vardır. Pazartesi PCNA'nın polimerazı kalıpta tuttuğunu görmüştük; Burgers ile Kunkel ve Sun ekibi aynı kelepçenin olgunlaşmanın enzimlerini sırayla taşıdığını yazar.

Bakteride iş daha kısadır. Polimerazlar dersinde Pol I'in asıl kopyalayıcı olmadığını, onarım ve primer yerlerini doldurmakla uğraştığını görmüştük. OpenStax de, Wikipedia'da enzime ayrılan sayfa da aynı işi anlatır: Pol I 5'→3' yönlü ekzonükleaz alanıyla önündeki RNA'yı siler, boşluğu DNA ile doldurur; anı yazısı RNaz H'nin de katkı verdiğini, iki etkinlik birden bozulunca parçaların biriktiğini anlatır. Ökaryottaki RNaz H2'nin payı daha az açıktır. Burgers ile Kunkel de RNaz H üzerine Wikipedia maddesi de onun belirgin işini DNA'ya tek tek karışmış ribonükleotitleri kesmek diye anlatır; Sun ekibi mayada RNaz H olmadan da kopyalamanın sürdüğünü aktarır.

Silinen yalnız RNA değildir. Smith ile Whitehouse'a göre hataya açık Pol α'nın yazdığı DNA'dan genomda neredeyse iz kalmaz; Burgers ile Kunkel de çentik kaydırmanın düşük doğruluklu DNA'yı Pol δ'nın yazdığıyla değiştirdiğini söyler.

Son bağ

OpenStax, Shuman'ın 2009 derlemesi ve Tomkinson ekibinin 2020 derlemesi ligazın bu boşluğu bir ucun 3'-OH'u ile öbür ucun 5' fosfatı arasında bağ kurarak kapattığını yazar.

Bağ üç adımda kurulur. Tomkinson ekibinin anlattığı, Wikipedia'nın da verdiği sırayla enzim önce kendi etkin bölgesindeki bir lizine AMP takar, sonra AMP'yi parçanın 5' fosfatına aktarır; son adımda 3'-OH bu etkinleşmiş fosfata saldırır ve AMP ayrılır. AMP'nin kaynağı canlıya göre değişir: E. coli ligazı onu NAD⁺'dan, insan ligazları ATP'den alır.

Her parça bir primer, bir söküm ve bir birleştirme ister. İnsan hücresinde 3,8 × 10⁷ birleştirme o kadar ATP'yi AMP'ye çevirir; ayrılan pirofosfat da yıkılırsa iki katı, 7,5 × 10⁷ yüksek enerjili bağ eder. Polimerazlar dersindeki 2,5 × 10¹⁰'luk faturaya oranı 7,5 × 10⁷ ÷ 2,5 × 10¹⁰ ≈ 0,003'tür: binde üç. Birleştirmenin bedeli enerji değil, sayıdır.

Modelin sınırı

• Parça boyunun nükleozomla belirlendiği bilgisi tek bir maya çalışmasının yüksek çözünürlüklü ölçümüne dayanır. İnsanda nükleozom tekrarı mayadakinden uzundur; Kromatin Organizasyonu dersinin 200 baz çiftilik değeri yol gösteriyorsa çarşambanın varsayımı tesadüfen yakın düşmüş olabilir, ama bu bir çıkarımdır.
• Kanat yollarının ağırlığı tartışmalıdır. Sun ekibine göre Dna2'si silinmiş mayada dizilenen parçalar olağandan pek ayrılmıyor; uzun kanat yolu yalnız sentromer gibi belirli bölgelerde belirleyici olabilir.
• Okazaki deneyleri soğutulmuş bakteride yapıldı; parça boyunun yirmi derece ile 37 derece arasında nasıl değiştiğine bu kaynaklar değinmiyor.
• Ligaz I'in yokluğunda insan hücrelerinde ligaz III'ün kısmen yerini aldığı Tomkinson ekibinin derlemesine dayanır; yedeğin ne kadarını üstlendiğini derleme ölçmüyor.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Parçaların birleşmesini "hızlandırdığı" ya da çentikleri "kapattığı" ileri sürülen takviyeler burada savunulmuyor; aktarılan deneylerin malzemesi bakteri, faj, maya ve arıtılmış enzimlerdi. Ligaz I'i bozan kalıtsal değişikliklerin bazı bağışıklık yetmezliği tablolarıyla ilişkisi modülün vaka dersine kalıyor.

Sayım çıktısı panoda

Ekin dört grafiği mantar panoya iğneliyor, en alta jel fotoğrafını koyuyor. Çıktının boş kenarına kurşun kalemle yazıyor: "2 s × 1.000 nt/s = 2.000 nt; 1.500 ÷ 1.000 = 1,5 s"; "4,6 × 10⁶ ÷ 1.500 ≈ 3.100"; "6,2 × 10⁹ ÷ 165 ≈ 3,8 × 10⁷"; "7,5 × 10⁷ ÷ 2,5 × 10¹⁰ ≈ 0,003".

Feriha Hanım dördüncü grafiğin tepesindeki zirveye parmağını koyuyor. "Bunlar ligazı bekliyordu," diyor. "Ama ligaz yalnız dikiş atar, harfi okumaz. Yanlış harfin nerede ve kimin tarafından yakalandığını pazartesi arayacağız."

Kendini sına

1. İnsan geciken parçaları ortalama 185 nükleotit olsaydı kaç parça çıkardı? Çarşambanın 200'lük varsayımıyla farkı ne olurdu?
2. Okazaki ekibi nabzı 37 derecede on saniye verseydi alkali gradyanda ne görmeyi beklerdin? Neden?
3. Ekin'in dördüncü kabındaki suşu izin veren sıcaklığa geri alıp kovalasaydı sayım nereye giderdi?
4. CAF-1'i eksik bir mayada ligaz baskılansaydı jeldeki merdiven nasıl değişirdi?
5. E. coli parçaları bin nükleotit olsaydı genomda kaç parça birleştirilirdi? Bu birleştirmeler hangi molekülden enerji alırdı?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste parçaların yakalandığını, boylandığını, primerlerinin söküldüğünü ve çentiklerinin kapandığını gördük. Replikasyon Hata Düzeltmesi dersi yazılan harflerin doğruluğuna dönecek: polimeraz yanlış eklediği son nükleotidi 3'→5' ekzonükleaz alanıyla nasıl geri siler, doğru nükleotit seçimi, düzeltme okuması ve yanlış eşleşme onarımı (mismatch repair) hata oranını hangi basamaklarla düşürür? Onarım, kopyalamadan sonra yeni zinciri eskisinden nasıl ayırt eder; bakteride metilasyon, ökaryotta henüz kapanmamış çentikler bu ayrımda ne rol oynar?