Öncü ve Geciken Zincir

Ekranda gidip gelen uç

Martın üçüncü haftasının çarşambası; Bingöl'de sepken dinmiş, saçaklardan su damlıyor. Feriha Hanım floresan mikroskobunun ekranını ikiye bölmüş, iki kanalı yan yana açmış.

Ekin dün akşam iki kanalın camına aynı DNA'yı bağlamıştı: bir ucu cama yapışık, öbür ucu çatal biçiminde açılmış moleküller; öncü kalıba kısa bir başlangıç parçası önceden eşlenmiş. Akış molekülleri yatırıyor, çift zinciri boyayan turuncu bir boya onları ince çizgiler hâlinde gösteriyor. Birinci kanalda arıtılmış bakteri replisomunun bütün parçaları, dNTP'ler ve primazın ribonükleotitleri var; ikincide yalnız primaz eksik.

Birinci kanalda çizgilerin serbest ucu beş saniye kadar cama doğru geri çekilip yarım mikron kısalıyor, sonra bir anda eski yerine sıçrıyor; kısa bir duraksamadan sonra yeniden çekiliyor. Aralar düzensiz: bir döngüde dört saniye, ötekinde on bir. İkinci kanalda hiçbir çizgi kısalmıyor; ucun arkasında, tek zincir bağlayan proteinin yeşil ışığı gittikçe uzayan soluk bir kuyruk bırakıyor.

"Primazı çıkarınca ritim gitti, yazım gitmedi," diyor Ekin. "Kollardan biri yazmayı sürdürüyor, öbürü primazsız hiç başlayamıyor. Uç neden kısalıp uzuyor?"

Mekanizma

Ters bakan iki kalıp

Antiparalellik dersinde çift sarmalın iki zincirinin ters yönlerde uzandığını görmüştük. Pazartesi de polimerazın 5'→3' dışında bir yöne yazamadığını bulduk. Çatalda bu iki kural karşı karşıya gelir. Helikaz sarmalı tek bir yönde açar; açılan kalıplardan biri o yöne 3' ucuyla, öbürü 5' ucuyla bakar.

OpenStax'in anlatımına ve Wikipedia'nın geciken zincir parçaları maddesine göre 3'→5' kalıbın karşısındaki yeni zincir çatalla aynı yöne yazılır, helikazın arkasından kesilmeden uzar. Öbür kalıbın karşısındaki zincir çataldan uzaklaşan yönde yazılmak zorundadır: polimeraz açılmış kısa bir aralığı doldurur, çatal ilerledikçe yeni açılan yere dönüp baştan başlar.

Kromozom uçlarını işlediğimiz derste ucun eksik kalmasını kesintili zincirin son başlangıç parçasına bağlamıştık. Ayrımın bedeli primerdir. OpenStax de, Wikipedia'daki kopyalama yazısı da öncü zincirin tek primerle yetindiğini, geciken zincirin her parça için yenisini istediğini yazar. Ekin'in ikinci kanalı tam bunu gösteriyor: önceden eşlenmiş ucu olan öncü kol yazmayı sürdürüyor, geciken kalıp ise tek zincir olarak açıkta kalıyor ve bağlayıcı proteinlerle kaplanıyor.

Primaz kaç kez çağrılır

Öncü kolun başı da bir primerle atılır. Martín-Rufo ile Lecona'ya göre bir başlangıç noktası ateşlenince Pol α–primaz iki zincire de ilk ucu koyar; öncü kolda bu ucu önce Pol δ uzatır, CMG'ye yetişince iş Pol ε'ye geçer. Burgers ve Kunkel de Pol α'nın başlangıçlarda iki zinciri birden başlatabileceğini yazar; pazartesi tarttığımız iş bölümü çatal yola çıktıktan sonrasını anlatıyordu.

Başlangıç noktaları dersinde ökaryot çatalının dakikada bin nükleotit kadar ilerlediğini bulmuştuk. Geciken kolun parça boyu sonraki dersin konusu. Hesap için her parçayı 200 nükleotit varsayalım; bu bir ölçüm değildir. Böyle bir çatalın geciken kolu dakikada 1.000 ÷ 200 = 5 kez yeniden başlar ve her döngü 200 ÷ 16,7 ≈ 12 saniye sürer.

Pazartesi bir S evresinde eklenen nükleotitleri 1,24 × 10¹⁰ bulmuştuk; yarısı geciken zincirlere düşer. 200'lük parçalarla bu 1,24 × 10¹⁰ ÷ (2 × 200) = 3,1 × 10⁷ primaz çağrısı demektir. Öncü kollarda ise her başlama olayı zıt yönlere giden iki çatal açar ve her çatalın öncü kolu bir kez başlar. Hyrien ekibinden aktardığımız tahmin 25 bin ile 50 bin arasıydı; bu, 50.000 ile 100.000 öncü başlatma eder. Oran 3,1 × 10⁷ ÷ 10⁵ ≈ 310 ile 3,1 × 10⁷ ÷ (5 × 10⁴) ≈ 620 arasındadır. Ritmi primaz tutar: Graham ekibi geciken zincirin periyodunu primazın belirlediğini yazar, Martín-Rufo ile Lecona da bakteri düzeneklerinde primaz miktarının parça sayısını belirlediğini aktarır.

Kalıp kendi üstüne kıvrılır

Geciken polimeraz çataldan uzaklaşan yönde yazıyorsa, çatalla ilerleyen makineden her parçada biraz daha uzaklaşmalıdır. Bruce Alberts ve ekibi T4 fajının arıtılmış kopyalama sistemiyle çalışırken bir çözüm önerdi. Wikipedia'nın kopyalama maddesi öneriyi 1980'e koyar; Yao ile O'Donnell'in 2008 yazısı ve Burgers ve Kunkel'in derlemesi de onu ekibin 1980 tarihli makalesine dayandırır.

Öneriye göre geciken kalıp replisomun yanında kendi üstüne kıvrılıp ilmek yapar; geciken polimeraz kalıbı içinden geriye çekerken öncü polimerazla aynı yöne bakar. Parça bitince ilmek bırakılır, primaz çatalın dibine yeni bir uç koyar ve yeni bir ilmek kurulur. Wikipedia benzetmeyi adıyla verir: ilmek, trombonun sürgüsü gibi içeri girip çıkar.

Ekin'in birinci kanalındaki ritim budur. Hamdan ekibi 2009'da T7 fajının replisomunu aynı düzenle izledi: DNA geciken zincirinden cama bağlıydı, ilmek kurulurken ilmekte saklanan DNA kadar kısalıyor, bırakılınca hızla eski boyuna dönüyordu. Primaz ya da polimeraz durdurulunca kısalmalar yok oldu.

DNA Çift Sarmalı dersindeki 0,34 nanometrelik basamak aralığıyla Ekin'in yarım mikronu 500 ÷ 0,34 ≈ 1.470 baz çifti eder: kabaca bir buçuk kilobazlık bir ilmek. Beş saniyede kurulduğuna göre saniyede 1.470 ÷ 5 ≈ 294 baz çifti büyüdü. Hamdan ekibi ilmeğin büyüme hızını tek başına öncü yazımın yaklaşık iki katı bulup iki polimerazın katkısına bağladı; kurgu izde her polimeraz saniyede 294 ÷ 2 ≈ 147 nükleotit yazıyor. Yazarlara göre ilmeğin yarısı yazılmakta olan yeni parça, yarısı helikazın açtığı ama henüz kopyalanmamış tek zincirdir.

İlmek ne zaman bırakılır? Hamdan ekibinin bulduğu ve Bocanegra ekibinin aktardığı iki tetik var: primazın yeni bir başlangıç parçasını sentezlemeye başlaması ve geciken polimerazın önceki parçanın ucuna çarpması. Yazarlar bunu, makinenin her parçadan sonra zamanında sıfırlanmasını güvenceye alan bir yedek düzen sayar. Bırakmayı tetikleyen primaz adımı rastgele zamanlıdır; Ekin'in düzensiz aralarını bu açıklayabilir.

Bir yükleyicide iki çekirdek

İlmek iki polimerazın birbirine bağlı kalmasını ister. Burgers ve Kunkel'e, Yao ile O'Donnell'e ve Wikipedia'nın Pol III holoenzimi maddesine göre E. coli'de bu bağı kelepçe yükleyicinin τ alt birimleri kurar: aynı yükleyiciye bağlı iki τ birer Pol III çekirdeği taşır, biri öncü, öbürü geciken kolu yazar.

Reyes-Lamothe, Sherratt ve Leake 2010'da canlı E. coli hücrelerinde işaretli bileşenleri sayınca replisom başına üç polimeraz ve üç τ buldu; Yao ile O'Donnell üçüncü çekirdeğin takılan bir polimerazın yedeği olabileceğini aktarır.

Ökaryotta aday daha az kesindir: Burgers ve Kunkel'e göre mayada Ctf4 hem Pol α'ya hem GINS'e ve Pol ε'ye tutunabilir; insandaki karşılığı AND1'i Martín-Rufo ile Lecona da anar. İki derleme de bu bağın mayada vazgeçilmez olmadığını ekler.

Sıkı eşleme mi, ayrı yürüyüş mü

Trombon resmi iki polimerazın sıkıca eşlendiğini düşündürür. Bocanegra ekibine göre bu eşlemeyi açıklayan iki öneri öne çıkmıştı: ya primaz ve geciken yazım öncüyü geçici olarak durdurur ya da geciken polimeraz daha hızlı yazıp arayı kapatır.

Graham ekibi arıtılmış E. coli replisomunu halka biçimli bir kalıpta izledi. Primaz çıkarılınca öncü yazım benzer boyda ürün vermeyi sürdürdü. Tek tek izlerde iki polimerazın hızı rastgele değişiyor, yazım ara ara duruyordu. Polimeraz durduğunda helikaz açmayı sürdürüyor ama belirgin biçimde yavaşlıyor, polimerazın yeniden yetişmesine zaman tanıyordu; Łazowski ekibinin 2024 derlemesi de bu yavaşlamayı aktarır. Yazarlara göre iki zincir koordinasyon olmadan da eksiksiz kopyalanır, ortalamada görülen uyum rastgele olayların toplamından doğar.

Modelin sınırı

• İlmeğin doğrudan görüntüsü faj ve bakteri sistemlerinden gelir. Ökaryotta geciken polimerazın çatala ne kadar bağlı kaldığı açık bir sorudur; Martín-Rufo ile Lecona Pol α–primazın kısmen serbest çalıştığını öne sürer.
• Tek molekül deneyleri çıplak DNA'da ve çekme kuvveti altında yapılır; Hamdan ekibine göre kuvvet arttıkça ilmekler küçülür.
• Hesaptaki parça boyu bir varsayımdır ve başlatma sayısı onunla ters orantılıdır; çatal hızı ile başlama olayı sayısı da yalnız aralık olarak bilinir.
• Eşleme tartışması tek bir bakteri sistemine dayanıyor; Lewis ekibinin derlemesine göre T7'de tek tek replisomlar primer yazarken kimi zaman ilmek kurar, kimi zaman duraklar.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• İki zinciri "dengelediği" ya da kopyalamayı hızlandırdığı söylenen takviyelere bu dersten bir dayanak çıkmaz; aktarılan çalışmaların tümü arıtılmış proteinlerle ve mikroplarla yapıldı, hiçbirinde bir gıda ürünü yer almıyor. Geciken zincirin işlenmesindeki aksaklıkların kişiye etkisi kopyalama bozukluklarının vaka dersinde ele alınacak.

Bağcıklar masada

Feriha Hanım çantasından iki ayakkabı bağcığı ve bir anahtarlık halkası çıkarıyor, bağcıkları birbirine sarıp beyazı halkadan geçiriyor. "Halka helikaz, beyaz öncü kalıp," diyor. "Ellerin polimeraz."

Ekin iki yumruğunu halkanın arkasında birlikte ileri itiyor. Beyaz bağcık bir yumruktan düz akıyor; kırmızı öbür yumrukta ters yöne çekiliyor ve iki el arasında büyüyen bir kavis çiziyor. Birkaç parmak sonra Ekin yumruğunu açıyor, kavis düşüyor, eli kırmızıyı halkanın dibinden yeniden kavrıyor. "Ellerim aynı yöne gidiyor, bağcıklar ters bakıyor," diyor. "Aradaki fark ilmekte birikiyor."

Kurşun kalemle bağcıkların yanına not alıyor: "500 ÷ 0,34 ≈ 1.470 bp; 294 ÷ 2 ≈ 147 nt/s"; "1.000 ÷ 200 = 5 başlatma/dk, 200 ÷ 16,7 ≈ 12 s"; "3,1 × 10⁷ geciken / 5 × 10⁴–10⁵ öncü".

Feriha Hanım kırmızı bağcığı masaya seriyor. "Her bıraktığın ilmekten arkada kısa bir parça kaldı, başında da bir uç. Cuma o parçaları ilk kez yakalayan deneyi kuracağız."

Kendini sına

1. Geciken kol, dakikada iki kilobaz ilerleyen bir çatalda ve 200 nükleotitlik parçalarla dakikada kaç kez başlardı? Bir döngü kaç saniye sürerdi?
2. Parça boyu 400 nükleotit seçilirse geciken başlatma sayısı ve öncüye oranı nasıl değişir?
3. Ekin birinci kanaldan primaz yerine geciken kolu yazan polimerazı çıkarsaydı ekranda ne görmeyi beklerdin?
4. Kurgu izde uç sekiz saniyede 0,68 mikron kısalsaydı ilmek kaç baz çifti olurdu ve saniyede ne kadar büyürdü?
5. Öncü polimeraz durduğunda helikaz hiç yavaşlamasaydı öncü kalıpta ne birikirdi?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste geciken zincirin parçalarını yön kuralından ve ilmeğin ritminden çıkardık, kendilerini görmedik. Okazaki Parçaları dersi onları tüpe taşıyacak: bu kısa parçalar ilk kez hangi nabız etiketleme deneyiyle yakalandı, boyları bakteride ve ökaryotta neden farklıdır ve ökaryotta nükleozomlarla nasıl bir ilişki taşır? Her parçanın başındaki RNA primer nasıl sökülür, geride kalan çentikleri ligaz nasıl kapatır?