DNA Polimerazlar

Beş şeritlik jel

Pazartesi, martın üçüncü haftası. Bingöl'de gece yağan kar sabaha sulu sepkene dönmüş. Feriha Hanım jel görüntüleyicinin kapağını açıp ekranı Ekin'e çeviriyor.

Ekin cuma akşamı beş tüp kurmuştu. Her birinde üç bin nükleotitlik tek zincirli halka bir kalıp, kalıbın bir noktasına eşlenmiş kısa bir başlangıç parçası, dört deoksinükleotit trifosfat (dNTP) ve magnezyumlu bir tampon var; dNTP'lerden birinin bir kısmı floresan işaretli. Tüplere arıtılmış maya Pol δ'sı eklenmiş, ürünler on dakika sonra denatüre edici jelde ayrılmış.

Birinci şeritte kısa bir merdiven var: en uzun basamak birkaç düzine nükleotit. RFC, PCNA ve ATP eklenen ikinci şeritte merdivenin üstünde, kalıbın tam boyunda kalın bir bant parlıyor. Başlangıç parçası konmayan üçüncü şerit boş. dGTP'nin unutulduğu dördüncüde tek bir kısa bant duruyor. Magnezyum yerine onu bağlayan EDTA konan beşinci şerit de boş.

"Enzim aynı, nükleotitler aynı," diyor Ekin. "İkinci tüpe yalnız bir halka ekledim. Ürün nasıl yüz kat uzadı?"

Mekanizma

Bir uç olmadan iş yok

Sentromer ve telomer dersinde polimerazın ancak hazır bir 3' ucunu uzatabildiğini, işe kısa bir öncülle başladığını görmüş, kromozom uçlarının kısalmasını bu sınıra bağlamıştık. Ekin'in üçüncü şeridi aynı sınırı tüpte gösteriyor: kalıp, nükleotitler ve enzim yerinde, ama tutunacak bir 3'-OH olmadığı için hiçbir şey yazılmıyor.

Hücrede o ucu primaz verir. OpenStax'e göre bu enzim kalıba eşleşen beş ile on nükleotitlik bir RNA parçası yazar; Burgers ile Kunkel'in 2017 derlemesi ökaryot primazının ürününün on nükleotit dolayında sınırlandığını söyler.

Bağ nasıl kurulur

Fosfodiester bağını nükleotitler dersinde tanımlamıştık: bir şekerin 5' fosfatı komşu şekerin 3' hidroksiline ester bağıyla bağlanır. Polimeraz bu bağı gelen nükleotidin üç fosfatından en içtekiyle, α-fosfatla kurar. Wikipedia'nın Pol I ve kopyalama maddelerine göre zincirin ucundaki 3'-OH bu fosfata saldırır; dış iki fosfat birbirine bağlı kalarak ayrılır. Polimeraz maddesi tepkimeyi şöyle yazar: dNTP + DNAₙ ⇌ pirofosfat + DNAₙ₊₁.

Ok iki yönlüdür. Wikipedia'nın pirofosfat maddesi tersini de adlandırır: PPi zincirin ucundaki nükleotidi koparıp yeniden dNTP'ye çevirebilir. Hücre bunu PPi'yi ortadan kaldırarak önler. Wikipedia'nın kopyalama ve pirofosfat maddeleri, PPi'nin enzimle iki fosfata yıkılmasının ikinci bir yüksek enerjili bağı harcadığını ve tepkimeyi fiilen geri dönüşsüz kıldığını yazar. Eşleşmiş tepkimelerde ΔG'lerin toplandığını Gibbs enerjisini işlerken, Le Chatelier ilkesini denge sabitiyle birlikte görmüştük: PPi'nin yıkılması ürünün derişimini düşürür ve dengeyi uzama yönüne iter.

Çatal hızından başlayalım. Dakikada bin nükleotit yazan bir polimeraz saniyede 16,7 nükleotit ekler; bir ekleme altmış milisaniye kadar sürer. Diploit genomdaki her baz çiftinin iki zinciri de yeni bir eş alır, yani eklenen nükleotit sayısı baz çifti sayısının iki katıdır: yaklaşık 1,24 × 10¹⁰ nükleotit, o kadar PPi. Her nükleotide iki yüksek enerjili bağ düşerse bir S evresinin faturası 2,5 × 10¹⁰ bağdır.

İki magnezyum

Beşinci şerit boştu, çünkü EDTA magnezyumu bağlamıştı. Steitz 1993'te Klenow parçasının yapısından iki metal iyonlu bir mekanizma önerdi; Frontiers'ta 2022'de yayımlanan editoryal bu tarihi anlatır. Korunmuş iki aspartat, çoğunlukla magnezyum olan iki iyonu etkin bölgede tutar. Wikipedia'nın Pol I maddesine göre iyonlardan biri primerin 3' hidroksilini saldırıya hazırlar, öbürü ayrılan fosfatlardaki eksi yükü karşılar.

Yön neden hep aynı

Kimya ters yönde de kurulabilirdi: trifosfatı büyüyen zincirin ucunda taşıyıp gelen nükleotidin 3'-OH'unu ona bağlayan bir enzim düşünülebilir. Ballanco ile Mansfield'ın 2011 modeli böyle bir enzimin zayıf noktasını gösterir: zincirin ucundaki trifosfat kendiliğinden yıkılırsa yazım durur ve ucu onaracak ikinci bir iş gerekir. Bugünkü düzende enerji her seferinde gelen nükleotitle taşınır. Polimerazın bir de yanlış eklenen son nükleotidi geri silen bir alanı var; ters yönde yazan bir enzimde bu silme etkin ucu da götürürdü. O alanın çalışması hata düzeltmesi dersinde açılacak.

Avuç, parmaklar, başparmak

Wikipedia'nın polimeraz maddesi ile Bębenek ve Ziuzia-Graczyk'in 2018 derlemesi enzimi sağ ele benzetir. Avuç katalitik aspartatları taşır. Parmaklar gelen dNTP'yi kalıp bazının karşısına oturtur; derlemeye göre doğru nükleotit bağlanınca avuca doğru kapanırlar. Başparmak primer ile kalıbın oluşturduğu çift sarmalı tutar.

Kapanan parmaklarla avuç yeni baz çiftinin çevresinde dar bir cep kurar. Derlemeye göre bu cebe yalnız kurallı eşleşmenin geometrisi uyar ve enzim bunu pirimidinin O-2 ve pürinin N-3 atomlarından okur. Antiparalellik dersinde A–T ile G–C çiftlerinin omurgaları aynı uzaklıkta tuttuğunu görmüştük; polimerazın denetlediği de bu ortak biçimdir. Dördüncü şeritteki tek bant aynı kuralın sonucudur: kalıpta ilk C'ye gelinince karşısına konacak G yoktur ve zincir orada kalır.

Kornberg'in enzimi, Cairns'in mutantı

Wikipedia'nın polimeraz maddelerine göre Arthur Kornberg ve ekibi ilk DNA polimerazını 1956'da E. coli özütünden buldu. NobelPrize.org, 1959 Fizyoloji veya Tıp ödülünün Severo Ochoa ile Kornberg'e RNA ve DNA'nın biyolojik sentezindeki mekanizmaları keşifleri için verildiğini yazar.

Bu enzim, Pol I, hücrenin asıl kopyalayıcısı sanıldı. Paula De Lucia ile John Cairns 1969'da Nature'da mutajenle işlenmiş birkaç bin E. coli kolonisini tek tek denediklerini ve özütünde normal polimeraz düzeyinin yüzde birinden azı kalan bir mutant bulduklarını bildirdi. Mutant normal çoğalıyor, yalnız morötesi ışığa daha duyarlı oluyordu. Wikipedia'nın Pol I maddesine göre Pol I'in işi çoğunlukla onarım ve primerlerin yerini doldurmaktır; asıl kopyalayıcı daha sonra bulunan Pol III'tür. OpenStax ile aynı madde E. coli çatalının saniyede bin nükleotit kadar yazdığını verir; 1.000 ÷ 16,7 ≈ 60, bakteri çatalı bizimkinden altmış kat hızlıdır.

Üç polimeraz, tek çatal

OpenStax ökaryot kopyalamasında üç polimeraz sayar: α, δ ve ε. Pol α primazla tek bir kompleks kurar ve RNA primerin ardına kısa bir DNA parçası ekler; OpenStax de Burgers ile Kunkel de bu parçayı yirmi ile otuz nükleotit verir. Pol α'nın düzeltme yapan silme alanı yoktur ve süreçliliği düşüktür. Uzun yazımı öbür ikisi devralır.

Hangisi hangi kolu yazar? Burgers ile Kunkel'in özetlediği maya deneylerinde etkin bölgesi değiştirilmiş Pol ε'nin DNA'ya bıraktığı izler öncü zincirde, değişik Pol α ve Pol δ'nın izleri geciken zincirde toplanır. Wikipedia'nın Pol ε maddesi de onu öncü zincirin başlıca polimerazı sayar. Bu iki zinciri sonraki ders kuracak.

Hasarlı bazın karşısına nükleotit koyabilen özel polimerazları onarım dersleri işleyecek.

Kelepçe

Moleküler motorlar dersinde süreçliliği ipten kopmadan atılan adım sayısıyla ölçmüş, kinezinde yüz kadar adım bulmuştuk. Polimerazın ipi kalıptır. Burgers ile Kunkel'e göre Pol δ'nın kendi süreçliliği çok düşüktür ve PCNA ile büyük ölçüde artar; Pol ε ise yeni çift sarmalı saran küçük bir alan sayesinde tek başına da uzun yazar. Chilkova ekibinin 2007 ölçümünde maya Pol δ'sı tek bağlanışta PCNA yokken altı nükleotitten uzun ürün veremedi, PCNA ile altı yüzü aştı.

Kapalı bir halka DNA'ya kendiliğinden geçemez. Hedglin, Kumar ve Benkovic'in 2013 derlemesine göre kelepçe yükleyiciler ATP harcayarak halkayı açar ve primer–kalıp kavşağının 3' ucuna takar. Wikipedia'nın RFC maddesine göre ökaryotun beş alt birimli yükleyicisi RFC, ATP yıkılınca halkayı DNA üstünde bırakıp ayrılır. Ekin'in ikinci tüpüne konan ATP de buydu. Döngü ekstrüzyonundaki kohesin de DNA'yı içinden geçiren bir halkaydı; PCNA ise ilmek çekmez, polimerazla birlikte kayar.

Ekin'in sorusu buradan çözülür. Kelepçesiz bir Pol δ bin nükleotitlik bir yol için 1.000 ÷ 6 ≈ 167 kez bağlanıp kopmak zorundadır; çatal hızında altı nükleotit 6 ÷ 16,7 ≈ 0,36 saniyede biter. Kelepçeyle aynı yol 1.000 ÷ 600 ≈ 2 bağlanışa iner. Birinci şeritteki merdiven ilk sayının, ikinci şeritteki tam boy bant ikincisinin görüntüsüdür.

Modelin sınırı

• İş bölümü mayada en iyi kurulmuştur; insan hücresinde kanıtın bir kısmı tümör dizilerindeki mutasyon desenlerinden dolaylı gelir ve tartışma kapanmamıştır.
• Süreçlilik sayıları çıplak kalıpta, kromatinsiz ölçüldü; çatalda helikaz, RPA ve nükleozomlar polimerazın ne kadar yazacağını değiştirir.
• İki metal iyonu şeması donmuş kristallerden gelir; bazı polimerazlarda üçüncü bir iyon gözlenmiş, rolü henüz bağlanmamıştır.
• Ters yönde yazmama gerekçesi bir evrim modeli ve akıl yürütmedir; ters yönlü bir polimerazın yokluğu doğrudan sınanamaz.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• DNA sentezini ya da onarımını "destekleyen" diye sunulan takviyeler için burada dayanak yok; jeldeki ve derlemelerdeki deneylerde böyle bir ürün hiç denenmedi. Polimerazı hedef alan ilaçlar da, düzeltme alanını bozan değişikliklerle ilişkili kanserler de kopyalama bozukluklarını işleyecek vaka dersine kalıyor.

Jel kururken

Ekin defterin kenarına sayıları diziyor: "16,7 nt/s → ekleme başına ≈ 60 ms"; "S evresinde ≈ 1,24 × 10¹⁰ PPi"; "1.000 ÷ 6 ≈ 167, 1.000 ÷ 600 ≈ 2". Altına bir el çiziyor, avucunda iki küçük daire, başparmağının çevresinde bir halka.

Feriha Hanım görüntüyü kaydedip kapağı kapatıyor. "Bu kalıp tek zincirdi, tek yöne yazdık," diyor. "Çatalda iki kol var ve biri ters bakıyor. Çarşamba ikisine birden bakacağız."

Kendini sına

1. Çatal dakikada bin beş yüz nükleotit ilerleseydi bir ekleme kaç milisaniye sürerdi? PPi sayısı değişir miydi?
2. Pirofosfataz durdurulmuş bir tüpte PPi birikirse uzayan zincirin ucuna ne olabilir? Hangi tepkime öne çıkar?
3. EDTA'lı tüpe EDTA'dan fazla magnezyum eklenseydi beşinci şeritte ne görmeyi beklerdin?
4. Kalıbı 5'-…GCATTC…-3' olan bir bölgede dATP'siz bir tüpte zincir hangi noktada durur? Yazılan zincirin yönünü göz önüne al.
5. RFC'si olan ama ATP'si olmayan bir tüpte ikinci şerit neye benzerdi?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste polimeraz tek bir kalıpta, tek bir uçtan, tek yöne yazdı. Öncü ve Geciken Zincir dersi çatala dönecek: helikaz iki kolu birlikte açarken polimeraz yalnız 5'→3' yazabiliyorsa, kollardan biri neden kesintisiz, öbürü neden parça parça kopyalanır? Geciken kolda primaz neden tekrar tekrar çağrılır ve aynı replisom zıt yönlü iki işi ilmek kurarak nasıl birlikte götürür?