Helikaz ve Replikasyon Çatalı

Mıknatısın altındaki boncuk

Cuma öğleden sonra; Bingöl'de tepelerin karı güneşte parlıyor. Feriha Hanım bodrumdaki manyetik cımbızı açmış. Cam bir akış hücresinin tabanına binlerce baz çiftlik DNA molekülleri tutturulmuş; her molekülün öbür ucunda mikron boyunda bir manyetik boncuk asılı. Üstteki mıknatıslar boncukları yirmi pikonewtonla yukarı çekiyor, kamera her boncuğun yüksekliğini nanometre duyarlığıyla izliyor. Moleküllerin ucunda kısa bir tek zincir kuyruğu var; Ekin oraya arıtılmış helikaz yüklemiş.

ATP'li tampon kanala girince boncuklar tırmanmaya başlıyor. Tırmanış düzgün değil: Ekin'in ekranındaki izde basamaklar, uzun duraklamalar, arada birkaç baz çiftlik geri kaymalar var. Otuz dakikanın sonunda ortalama iz 500 baz çiftinin açıldığını gösteriyor. Aynı helikazın ATP'siz tamponla doldurulmuş komşu kanalındaki izler ise yatay bir çizgi.

Masada perşembe hazırlanmış ikinci bir dizi cam var: Ekin çarşambaki hücrelerin kardeş kültürüne aynı iki etiketi, bu kez topoizomerazı durduran bir maddeyle birlikte vermiş. Yeşil şeritler kısalmış: ortalama 9 kilobaz, çarşamba 21'di.

"Bu madde helikaza dokunmuyor," diyor Ekin. "Zinciri açan o değil. Çatal neden yavaşladı?"

Mekanizma

Yüklenen halkadan çalışan helikaza

Çarşamba MCM2–7 halkalarının G1'de başlangıç noktalarına baş başa ikili olarak oturtulduğunu ve bu çift halkanın henüz bir şey açmadığını görmüştük. Moyer, Lewis ve Botchan 2006'da sinek embriyosu özütünden Cdc45 adlı proteini arıtırken onun MCM2–7 altılısı ve dört alt birimli GINS ile kararlı bir kompleks kurduğunu buldu; kompleks ATP'ye bağlı helikaz etkinliği taşıyordu. Kısaltma bu üç parçadan gelir: CMG. Ökaryotta zincirleri ayıran motor bu komplekstir ve katalitik çekirdeğini MCM2–7 kurar; Burnham ekibinin 2019 makalesi de Wikipedia'nın MCM maddesi de bunu yazar.

Moleküler Motorlar dersindeki kinezin ATP'yi bir ip üstünde adıma çeviriyordu; helikazın ipi DNA'nın kendisidir. Burnham ekibine ve Wikipedia'nın helikaz maddesine göre MCM alt birimleri AAA+ ailesindendir. Proteazomun kapağındaki altı ATPazlık halka da bu ailedendi ve yükü kanalından itiyordu; MCM halkası DNA'yı içinden geçirir.

Bir zincir içeride, öbürü dışarıda

Halka hangi zinciri içine alır? Fu'nun ekibi 2011'de kurbağa yumurtası özütünde kopyalanan bir DNA'nın iki zincirine ayrı ayrı iri protein engelleri bağladı. Öncü zincir şablonundaki engel helikazı durdurdu, geciken zincir şablonundaki engeli helikaz kolayca aştı. Yazarlara göre CMG tek zincir üstünde 3'→5' yönünde ilerler: bir zinciri halkanın kanalından geçirir, öbürünü dışarıda bırakıp sıyırır. Fu ekibine göre G1'de çift sarmalı saran halka S evresinde tek zinciri saran bir biçime geçer.

Bakteri aynı işi ters yönden yapar. Wikipedia'nın DnaB maddesine göre bakteri helikazı DnaB altı özdeş alt birimlik bir halkadır, geciken zinciri kanalında taşır ve 5'→3' yönünde ilerler; Burnham ekibi de bu farkı vurgular. İki zincir antiparalel olduğu için halka hangi zincirde yürürse yürüsün çatalla aynı yöne gider.

ATP'nin bütçesi

Eickhoff ve arkadaşlarının 2019 kriyo-elektron mikroskopisi çalışmasında tek zincirin fosfatları ayırt edilebiliyordu; her MCM alt birimi iki nükleotide dokunuyordu ve yazarlar bir alt birimlik adımı iki nükleotitlik ilerleme diye modelledi. Yuan ekibinin 2016 makalesi başka halkalı helikazlar için ATP başına bir ya da iki nükleotitlik adım önerildiğini aktarır. Bu bir model değeridir, ölçülmüş bir oran değil.

Hesap yine de bir mertebe verir. Çarşamba lif şeritlerinden dakikada bin baz çifti bulmuştuk: 1.000 ÷ 60 ≈ 16,7 baz çifti/saniye. ATP başına iki baz çiftiyle çatal başına saniyede 16,7 ÷ 2 ≈ 8, bir baz çiftiyle 17 ATP yakılır. Kinezin tüpte saniyede 100 ATP yakıyordu; helikaz altı ile on iki kat daha ağır çalışır.

Ekin'in izi bunun da altında: 500 ÷ 1.800 ≈ 0,28 baz çifti/saniye, hücredekinin altmışta biri. Burnham ekibinin sinek CMG'si de cımbızda saniyede birkaç onda bir baz çifti açtı, hücredeki çataldan on ile yüz kat yavaştı, sık sık durdu ve geri kaydı. Yazarlara göre halka ileriye yatkın bir rastgele yürüyüş yapar; hücrede bu yatkınlığı polimeraz ve eşlik proteinleri güçlendirir. ATP ya da CMG yokken onlar da hiçbir açılma görmedi.

Boncuk neden yükseliyor? Helikaz ilerledikçe çift sarmalın bir kısmı tek zincire döner ve bu gerilimde tek zincir daha uzun durur. Burnham ekibi boncuğun yüksekliğini tümüyle çift ve tümüyle tek zincirli DNA'nın boylarıyla karşılaştırıp açılan baz çifti sayısına çeviriyordu.

Y'nin iki kolu ve RPA

OpenStax'e göre DNA açıldıkça Y biçimli yapılar, çatallar oluşur. Ekin'in çarşambaki kırmızı merkezli deseninde iki yana uzanan yeşil şeritler, aynı noktadan zıt yönlere çıkan iki çatalın iziydi.

Çatalın kollarında tek zincir açıkta kalır. Wikipedia ile Chen ve Wold'un 2014 derlemesine göre ökaryotta onu yakalayan başlıca protein RPA'dır. RPA 70, 32 ve 14 kilodaltonluk üç alt birimden kurulur ve dört DNA bağlayan bölgesiyle tek zincire sarılır; Chen ile Wold kararlı bağlanmayı otuz nükleotit dolayında verir. OpenStax bakterideki karşılığının tek zinciri kaplayıp yeniden sarmala kapanmasını engellediğini yazar. Chen ile Wold klasik görevi tek zincirin firkete gibi ikincil yapılar kurmasını ve nükleazlarca yıkılmasını önlemek diye özetler; tek molekül çalışmalarına göre RPA zincir boyunca hızla kayar ve sırası gelen proteinlere yer açar.

Önde biriken turlar

Açılmanın bir bedeli var. Çift sarmal dersinde B biçiminin her 10,5 baz çiftinde bir tur attığını görmüştük. Uçları serbestçe dönemeyen bir DNA'da bu turlar açılmayla yok olmaz, ileri itilir. OpenStax, Wikipedia'nın topoizomeraz maddesi ve Keszthelyi ekibinin 2016 derlemesi çatalın önünde artı yönde, yani fazla sarılmış süper sarmallar biriktiğini yazar. Bu birikim giderilmezse sarmal daha fazla açılamaz ve çatal durur.

Hızı hesaplayalım. Dakikada bin baz çifti açan bir çatalın önüne 1.000 ÷ 10,5 ≈ 95 tur birikir, saniyede 1,6 tur. Sekiz saatlik bir S evresinde 13.000 çatalın birlikte çalışması gerektiğini çarşamba hesaplamıştık; 13.000 × 1,6 ≈ 21.000 tur saniyede çekirdeğin bir yerlerinde çözülmelidir. Çift sarmal dersinde diploit genomun tamamı için bulduğumuz 5,9 × 10⁸ tur, S evresi bitmeden sökülmesi gereken toplamdır.

Pommier ekibinin 2016 derlemesi ile Wikipedia'nın topoizomeraz maddesi şunu anlatır: ökaryotun I. tip topoizomerazı bir zinciri keser ve kesik zinciri sağlam zincirin çevresinde denetimli biçimde döndürür; ATP harcamaz. II. tip topoizomeraz iki zinciri birden keser, açılan kapıdan ikinci bir çift sarmal parçasını geçirir ve kesiği kapatır; bu döngü ATP ister. Wikipedia'nın II. tip maddesine göre her geçiş bağlanma sayısını iki birim değiştirir. Keszthelyi ekibi iki enzimin de çatalın önünde çalıştığını yazar.

Ekin'in sorusunun cevabı buradadır. Topoizomerazı durduran madde helikaza dokunmaz, ama önündeki turları sökecek eli bağlar; gerilim birikir ve çatal yavaşlar. Kurgu şeritlerde 9 ÷ 20 ≈ 0,45 kilobaz/dakika, çarşambanın yarısından az.

Keszthelyi ekibine göre çatalın kendisi de dönebilir; o zaman öndeki turlar arkaya aktarılır ve yeni kopyalanmış iki kardeş sarmal birbirine dolanır. Bu dolanmaları ve kopyalama sonunda kalan katenanları ancak çift zinciri geçirebilen II. tip enzim çözer; yoksa kardeşler bölünmede ayrılamaz.

Birlikte ilerleyen makine

Helikaz çatalda yalnız değildir. Wikipedia'nın replisom maddesi ve Bell ile Labib'in 2016 derlemesi helikazın çevresinde toplanan bir takımı sayar: bir başlangıç ucu döşeyen primaz, yeni zinciri yazan polimerazlar, polimerazı DNA'ya bağlı tutan PCNA kelepçesi, onu yükleyen RFC, RPA ve topoizomerazlar.

Çatalın iki kolu zıt yönlere bakar; bu asimetrinin yazma işine etkisi öncü ve geciken zincir dersinde açılacak.

Çatal takıldığında

Zeman ile Cimprich'in 2014 derlemesi çatalın yavaşlamasını ya da durmasını kopyalama stresi diye tanımlar. Hasarlı bazlar, kendi üstüne kıvrılan diziler, yazılan genlerle çarpışma ve çözülmemiş burulma bunun kaynaklarıdır; Keszthelyi ekibi de bunları sayar. Bell ile Labib'e göre takılan çatalda helikaz ile polimeraz arasında tek zincir uzar, RPA birikir ve bu birikim hücrenin denetim kinazlarını çağırır. Çarşamba konuştuğumuz uyuyan noktalar böyle bir durumda devreye girer. Stresin hücre için sonuçları modülün kopyalama bozukluklarına ayrılan dersinde ele alınacak.

Modelin sınırı

• CMG'nin adım mekanizması çözülmüş değil: Eickhoff ekibi alt birimlerin el ele yürüyüşüne benzer dönen bir sıra önerir, Yuan ekibi ise halkanın tırtıl gibi büzülüp uzadığını düşünür.
• ATP başına baz çifti oranı yapı modellerinden gelir; tek molekül ölçümlerinde geri kaymalar ve duraklamalar her ATP'nin ileri adıma dönüşmediğini gösterir.
• Hesaplar her çatalın aynı hızla ve tek başına ilerlediğini varsayar; komşu çatalların burulmaları birbirine karışabilir, kromatin ve nükleozomlar burulmanın yayılmasını değiştirir.
• Tek molekül düzenekleri helikazı polimerazsız ve kromatinsiz çalıştırır.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Kopyalamayı "hızlandıran" ya da genomu "koruyan" diye sunulan bir gıda veya takviye için burada tek veri yok: helikaz, RPA ve topoizomerazlar üzerine anlatılan deneylerin hiçbiri böyle bir ürünü sınamadı. Topoizomerazları hedef alan kanser ve bakteri ilaçları da, bazı helikaz genlerindeki doğuştan kusurlarla görülen erken yaşlanma tabloları da burada işlenmiyor; ikincisi de kopyalama bozukluklarıyla birlikte gelecek.

Boncuklar dinlenirken

Ekin hesapları deftere geçiriyor: "1.000 ÷ 10,5 ≈ 95 tur/dk, 1,6 tur/s"; "16,7 bp/s ÷ 2 ≈ 8 ATP/s"; "500 ÷ 1.800 ≈ 0,28 bp/s, hücrenin 1/60'ı". Altına iki kollu bir Y çiziyor, bir kolun içinden geçen bir halka, öbür kolun çevresinde küçük boncuklar, çatalın önünde sıkışmış bir yay.

Feriha Hanım mıknatısları indirirken izi bir kez daha açıyor. "Halka yalnız yolu açıyor," diyor. "Yeni zinciri kimin, hangi yönde ve hangi uca yazdığını pazartesi göreceğiz."

Kendini sına

1. Dakikada iki kilobaz açan bir çatalın önüne saniyede kaç tur birikir? 10,4 baz çifti/tur alınca cevap nasıl değişir?
2. Bir helikaz ATP başına bir baz çifti açıyor ve saniyede 25 baz çifti ilerliyorsa saniyede kaç ATP yakar? Kinezinin 100 ATP'siyle karşılaştır.
3. Tek molekül düzeneğinde helikazın yüklendiği tek zincir kuyruğu 3' yerine 5' ucunda olsaydı CMG açılma başlatabilir miydi? Neden?
4. Çatal dönmesine izin verip II. tip topoizomerazı durdursaydın kopyalama sonunda ne görmeyi beklerdin?
5. RPA'sı azaltılmış bir hücrede açılan tek zincirde hangi iki sorun çıkar?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste helikaz yolu açtı ve RPA açılan zinciri tuttu. DNA Polimerazlar dersi yazma işine bakacak: polimeraz neden yalnız 5'→3' yönünde ve ancak hazır bir başlangıç ucunun 3'-OH grubuna ekleme yapabilir? Bir dNTP'den pirofosfat ayrılırken çıkan enerji yeni bağa nasıl aktarılır? Ökaryotta Pol α, Pol ε ve Pol δ işi nasıl bölüşür, PCNA kelepçesi polimerazı zincirde nasıl tutar?