Replikasyon Başlangıç Noktaları

Camdaki şeritler

Martın ikinci haftası, çarşamba sabahı. Bingöl'de üniversitenin genom bütünlüğü laboratuvarının penceresinden karlı tepeler görünüyor; içeride floresan mikroskobunun fanı uğulduyor. Ekin dün kültürdeki insan hücrelerine yirmi dakika birinci timidin benzerini, ardından yirmi dakika ikincisini vermiş. Feriha Hanım hücreleri parçalayıp DNA'yı silanlı camlar üstünde düz iplikler hâlinde germiş; antikorlar birinci etiketi kırmızı, ikincisini yeşil yakıyor.

Ekin ekranda yüzlerce ipliği tarıyor. Çoğunda bir kırmızı şeridin ucuna bir yeşil şerit eklenmiş. Bazılarında ise kırmızı ortada duruyor ve iki yanından birer yeşil şerit uzanıyor. Kilobaza çevirdiği yeşil şeritler ortalama 21 kilobaz çıkıyor. Birkaç iplikte yalnız kısa yeşil şeritler var. Bir iplikte kırmızı merkezli iki desen yan yana; merkezleri arasında 110 kilobaz var.

Tezgâhın öbür ucunda lisans laboratuvarından gelmiş dört fotoğraf duruyor: ağır azotla büyütülüp hafif azotlu ortama aktarılmış bir bakteri kültürünün sıfırdan üçe dört kuşağına ait santrifüj tüpleri. Birincide tek bant aşağıda, ikincide tek bant ortada, üçüncüde ortada ve yukarıda eşit iki bant, dördüncüde yukarıdaki bant ortadakinin üç katı koyu.

"Bakteri tüpünde bütün kromozom tek bir yerden açılıyor," diyor Ekin. "Bu camda her yüz kilobazda bir başlangıç var. Bu sıklık nereden geliyor?"

Mekanizma

Her yeni sarmalda bir eski zincir

Nereden başladığından önce kopyanın nasıl yapıldığı sorulmuştu ve üç model vardı; OpenStax da Wikipedia da onları aynı biçimde anlatır. Konservatif modelde eski sarmal bütün kalır, yanına tümüyle yeni bir sarmal kurulur; dağınık modelde eski ve yeni parçalar iki zincire karışık dağılır; üçüncü modelde iki zincir ayrılır, ikisi de yeni bir eşe kalıp olur.

Meselson ile Stahl 1958'de bunu yoğunlukla sınadı. Azotun ağır izotopuyla birkaç kuşak büyüttükleri bakterileri hafif azotlu ortama aktardılar, DNA'yı her kuşakta sezyum klorür gradyanında santrifüjlediler. Birinci kuşakta tek bir ara bant çıktı: konservatif model düştü. İkinci kuşakta ara bant ile hafif bant eşit miktarda yan yana durdu: dağınık model tek bir ara bant öngördüğü için o da düştü.

Hesap tüplerin dördüncüsünü de açıklar. Başlangıçtaki iki ağır zincir parçalanmaz, her kuşakta yalnız yeni sarmallara dağılır. n kuşak sonra sarmal sayısı 2ⁿ'dir ve bunlardan yalnız ikisi melezdir: 2 ÷ 2³ = 0,25. Üçüncü kuşakta sarmalların dörtte biri ortada, dörtte üçü yukarıda durur; koyuluk oranı 3'tür.

Bakterinin tek kapısı

OpenStax'e göre E. coli'nin 4,6 milyon baz çiftlik döngüsel kromozomu tek bir noktadan açılır ve iki çatal ters yönlere ilerleyip çemberin öbür yanında buluşur. Bu nokta iki yüz elli baz çifti dolayındadır: kitap 245, Wikipedia yaklaşık 260 baz çifti yazar. Wikipedia'nın DnaA maddesine göre DnaA adlı başlatıcı protein buradaki kısa tanıma kutularına bağlanır, DNA proteinin çevresine sarılır ve yakındaki adenin–timince zengin kesim açılır. A–T bakımından zengin bölgelerin ısıyla daha kolay ayrıldığını çift sarmalın erime basamaklarında görmüştük.

Bakteride tek kapı yeter. OpenStax çatalın saniyede yaklaşık bin nükleotit eklediğini yazar: 4,6 × 10⁶ ÷ (2 × 1.000) = 2.300 saniye, yani 38 dakika. Kitabın verdiği süre 42 dakikadır; Phillips ile Milo da iki çatal için en az 40 dakikalık bir alt sınır hesaplar.

İki metre, sekiz saat

İnsan hücresinde aynı hesap çöker. Diploit bir çekirdekteki DNA'nın uç uca eklenince iki metreyi biraz aştığını Kromatin Organizasyonu dersinde hesaplamıştık. Memeli çatalı bakterininkinden çok yavaştır: Bhattacharya ile Nagaraju'nun lif yöntemi yazısı da, Phillips ile Milo da ortalamayı dakikada bir kilobaz dolayına koyar; Hyrien, Guilbaud ve Krude'nin 2025 derlemesi lif ölçümlerinde dakikada yarım ile dört kilobaz arası ortalamalar aktarır. Ekin'in şeritleri bu aralıkta: 21 ÷ 20 ≈ 1,05 kilobaz/dakika.

Dakikada bin baz çiftiyle ilerleyen ve tek bir noktadan çıkan iki çatal 6,2 × 10⁹ ÷ (2 × 1.000) = 3,1 × 10⁶ dakika çalışırdı; bu altı yıla yakındır. Oysa Phillips ile Milo'ya göre memeli epitel dokularında kopyalamanın yapıldığı S evresi altı ile sekiz saat sürer, insan hücrelerinin çoğunda on saat mertebesindedir. Sekiz saate sığmak için 6,2 × 10⁹ ÷ (1.000 × 480) ≈ 13.000 çatalın, yani 6.500 dolayında başlangıç noktasının evrenin ilk dakikasında birlikte açılması gerekir.

Noktalar birlikte açılmadığı için gerçek sayı daha büyüktür; evrenin ortasında açılan bir nokta yalnız kalan süreyi kullanır. Lif ölçümleri komşu başlangıçlar arasında 50 ile 400 kilobaz arası mesafeler verir. Yüz kilobazlık aralıkla genomda 62.000 nokta olur ve her aralık iki yandan gelen çatallarla 50 dakikada kapanır. Hyrien ekibi bir S evresinde insan genomunda 25.000 ile 50.000 başlama olayı tahmin eder; Prioleau ile MacAlpine'in 2016 derlemesi de her döngüde on binlerce noktadan söz eder.

Mayada adres, memelide ortam

Mayada noktaların bir adresi vardır. Hyrien ekibi ile Prioleau ve MacAlpine, 1970'lerin sonunda bir halka DNA'nın maya hücresinde çoğalmasını sağlayan kısa parçaların arandığını ve özerk çoğalan diziler (autonomously replicating sequence, ARS) adıyla bulunduğunu anlatır. Wikipedia'nın iki maddesine göre bu diziler iki yüz baz çiftinden kısadır, A–T bakımından zengindir ve değiştiğinde noktayı bütünüyle susturan korunmuş bir öğe taşır. Bu öğeye başlangıç tanıma kompleksi, kısaca ORC (origin recognition complex) oturur.

Memelide böyle bir ortak dizi bulunamadı. Prioleau ile MacAlpine, hayvan hücrelerindeki ORC'nin deney tüpünde belirgin bir dizi seçmediğini ve hücrede DNaz I'e açık kromatinde, etkin promotörlerin ve güçlendiricilerin çevresinde biriktiğini yazar. Ökromatin ve Heterokromatin dersinde DNaz I duyarlılığını açık kromatinin ölçüsü olarak kullanmıştık. Hyrien ekibi noktanın yerini neyin belirlediğinin ayrıntıda anlaşılmadığını ekler.

Önce izin, sonra ateş

Başlangıç noktası iki adımda kullanılır. Blow ile Dutta'nın 2005 derlemesine ve Wikipedia'nın başlangıç öncesi kompleks maddesine göre ilk adım geç mitozda ve G1'de atılır. ORC noktaya oturur, Cdc6 ile Cdt1 adlı yardımcıları çağırır ve ATP harcanarak MCM2–7 adlı altı alt birimli halka DNA'ya geçirilir. Wikipedia'nın başlangıç noktası maddesine göre halkalar baş başa iki altılı hâlinde yüklenir ve bu çift halka henüz bir şey açmaz.

İkinci adım S evresinde gelir. Prioleau ile MacAlpine'e göre siklinle çalışan kinazlar (CDK) ve Dbf4'e bağlı kinaz (DDK) yeni proteinleri noktaya çağırır ve yüklü halka çalışan bir helikaza dönüşür. Kinazların bu döngüyü nasıl sıraladığı Hücre Döngüsü modülünün siklin dersinde işlenecek.

Aynı kinazlar ilk adımı kilitler. Wikipedia'ya göre S evresinde etkinleşen kinazlar yeni bir kompleksin kurulmasını engeller ve bu engel mitozun sonuna dek sürer. Klotz-Noack ile arkadaşlarının 2012 makalesi hayvan hücrelerinde iki kilidi daha anlatır: Cdt1 yıkılır, kalanı da geminin adlı proteine bağlanıp etkisizleşir. Bir noktadan geçen çatal geride halka bırakmaz ve döngü bitmeden yenisi yüklenemez.

Yüklenen ama yakılmayan

Wikipedia'nın başlangıç noktası maddesi ile Hyrien ekibi, memeli hücresinde aday noktaların ya da yüklü halkaların yalnız yüzde 10 ile 20'sinin bir S evresinde etkinleştiğini yazar. Prioleau ile MacAlpine ve Hyrien ekibi kalanları yedek olarak anlatır: komşu bir çatal yavaşlar ya da durursa bu uyuyan noktalar açılır ve aradaki boşluk kapanır.

Erken açılan, geç açılan

Kromozom Organizasyonu dersinin son sahnesinde koyu G bantlarına "en son kopyalanan yerler" denmişti. Hiratani ve Takahashi'nin derlemesine ve Hyrien ekibine göre ökromatin S evresinin başında, heterokromatin sonunda kopyalanır; erken bölgeler A bölmesine, geç bölgeler B bölmesine karşılık gelir. Bu iki bölmeyi, genomun üç boyutlu düzenine ayrılan derste temas haritalarından okumuştuk. Prioleau ile MacAlpine'e göre başlangıç noktaları da erken bölgelerde daha sıktır. Lif yönteminde yalnız yeşil şeritler ikinci darbede ilk kez açılan noktaları gösterir; Ekin'in camındakiler ateşlemenin S evresine yayıldığının izidir.

Sıra değişebilir. Prioleau ile MacAlpine, globin genlerinin yakınındaki bir başlangıç noktasının alyuvar öncüllerinde erken, başka hücrelerde geç açıldığını aktarır. Aynı derleme ile Hiratani ekibi, geç kopyalanan bir bölgeye histon asetilleyen bir enzim bağlanınca bölgenin erkene kaydığını yazar.

Modelin sınırı

• Hesaplar tek bir çatal hızı ve tek bir S süresi varsayar; ikisi de hücre tipine, gelişim dönemine ve strese göre değişir.
• Haritalama yöntemleri aynı genomda birkaç bin ile birkaç yüz bin arasında aday nokta verir; başlangıcın dar bir nokta mı, onlarca kilobazlık bir bölge mi olduğu tartışmalıdır.
• Lisanslamanın ayrıntıları çoğunlukla maya proteinleriyle deney tüpünde kurulmuş tepkimelerden gelir; insan hücresinde her adımın aynı işlediği tek tek gösterilmedi.
• Zamanlama ile kromatin arasındaki ilişkide neyin neden olduğu tam ayrılamadı; ikisi çoğunlukla birlikte kayar.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• DNA kopyalamayı ya da onarımı "desteklediği" söylenen bir besin, vitamin ya da takviyenin bu düzeneği değiştirdiğini bu dersin hiçbir bulgusu göstermez. Kopyalama stresinin kanserle ilişkisi ve lisans proteinlerindeki kalıtsal değişikliklerin yol açtığı nadir bir büyüme bozukluğu modülün bozukluklar dersine kalıyor.

Mikroskop kapanırken

Ekin hesaplarını defterin kenarına geçiriyor: "6,2 × 10⁹ ÷ 2.000 ≈ 3,1 × 10⁶ dakika, altı yıl"; "8 saat → en az 6.500 nokta, gerçekte on binlerce"; "üçüncü kuşak: 2 ÷ 8 = 0,25". Altına kırmızı merkezli deseni çiziyor ve ortasına "halka burada yüklenmişti" diye not düşüyor.

Feriha Hanım camı kutuya koyarken deseni gösteriyor. "Kırmızının ortasında bir halka ateşlendi," diyor. "Cuma o anı büyüteceğiz."

Kendini sına

1. Meselson ile Stahl deneyi dördüncü kuşağa sürdürülseydi sarmalların hangi payı ara bantta görünürdü?
2. Üç milyar baz çiftlik bir genom yalnız bir başlangıç noktasından dakikada 1,5 kilobazla açılsaydı kopyalama kaç gün sürerdi?
3. 120 megabazlık bir kromozomda komşu noktalar ortalama 80 kilobaz arayla açılıyorsa kaç başlama olayı beklersin?
4. Gemininden yoksun bir hücrede lif yaymasında hangi deseni görmeyi beklersin ve neden?
5. Uyuyan noktalar hiç kullanılmasa bile neden yüklenir? Bir çatal durunca ne işe yararlar?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste yüklenen MCM2–7 çift halkasını işe başlamadan bıraktık. Helikaz ve Replikasyon Çatalı dersi ateşleme anına bakacak: yakılan çift halka yeni ortaklarla nasıl CMG helikazına dönüşür ve iki zinciri ATP harcayarak nasıl ayırır? Açılan tek zincirleri tek zincir bağlayıcı protein (RPA) nasıl korur, çatalın önünde biriken aşırı sarılmayı topoizomerazlar nasıl çözer?