Ökromatin ve Heterokromatin

Enzimle ölçülen açıklık

Çarşamba, martın ilk haftası. Yağmur gece dinmiş. Ruhsar Hanım dün akşam bir kadın bağışçıdan türetilmiş fibroblast kültüründen çekirdekleri ayırıp buza koymuş. Aybars'ın tezgâhında üç tüp duruyor: birine enzim konmamış, ötekilere seyreltik DNaz I eklenmiş; biri on, biri otuz dakika sonra durdurulmuş.

Öğleden sonra her tüpte iki bölgenin ne kadar sağlam kaldığı ölçülüyor. Biri her hücrede durmadan çalışan bir ev işi geni, öbürü fibroblastta hiç yazılmayan bir globin geni. Enzimsiz tüpte ikisi de yüzde yüz. On dakikada ev işi geninden yüzde 37 kalmış, globin geninden yüzde 90. Otuz dakikada ilki yüzde 5'e inmiş, ikincisi yüzde 74'te duruyor.

Aynı kültürden bir lam floresan mikroskobunda bekliyor. Ruhsar Hanım yerinde melezlemeyle (FISH) XIST adlı RNA'yı yeşile boyamış. Her çekirdekte tek bir yeşil bulut var, çoğu zarfın kenarına yakın; bulutun altında çekirdek boyasını daha koyu tutan küçük bir leke seçiliyor.

Masanın köşesindeki fotoğrafta bir sirke sineğinin gözü var: kırmızı fasetlerin arasına düzensiz beyaz yamalar serpilmiş. Aybars fotoğrafı eline alıyor: "Göz rengi geni mi bozulmuş?" Ruhsar Hanım başını sallıyor: "Gen sağlam. Yeri değişmiş."

Farkı koruyan şey

Koyu ve soluk kromatinin adını, yapısal ile fakültatif ayrımını ve zarfa yaslanan yerini Kromatin Organizasyonu dersinde koymuştuk; pazartesi de makaranın kuyruklarını tanıdık. Şimdi sıra kalıcılıkta: açıklık nasıl ölçülür, sessizliği hangi protein okur ve komşulara nasıl yürür, bölünmede nasıl taşınır, bir kromozomun tamamı nasıl susar?

Metin

Enzimin gözünden

Tüplerdeki deneyin kökü 1976'dadır. PubMed'deki özetine göre Weintraub ile Groudine, çekirdekleri DNaz I ile DNA'nın yüzde onu sindirilecek kadar hafifçe kestiler. Tavuk alyuvarı çekirdeklerinden globin dizileri tercihli olarak kayboldu, fibroblast ve beyin çekirdeklerinde böyle bir kayıp görülmedi; alyuvarda yazılmayan ovalbumin geni ise sağlam kaldı. Yazarlara göre etkin genler de histonlara sarılıydı, ama enzime daha açık duruyordu. Henikoff ekibinin 2020 ve Adey'in 2021 makaleleri kromatin erişilebilirliğini haritalayan yöntemlerin başlangıcına bu çalışmayı koyar.

Kesimi birinci dereceden bir süreç sayarsak sağlam kalan pay e^(−kt) olur. Kurguda kapalı bölgeye k = 0,01/dk, açık bölgeye bunun on katı verildi. On dakikada kapalı bölgeden e^(−0,1) ≈ 0,905, açık bölgeden e^(−1) ≈ 0,368 kalır; otuz dakikada e^(−0,3) ≈ 0,741 ile e^(−3) ≈ 0,050. Yarılanma süreleri ln 2 ÷ k ile 6,9 ve 69 dakikadır. İki zaman noktasının aynı hız oranıyla uyması farkın kalıcı bir erişim farkı olduğunu düşündürür.

Bugün aynı soru bütün genomda sorulur. Wikipedia'nın maddesine göre 2013'te tanıtılan ATAC-seq, açık bölgelere dizileme bağdaştırıcıları yerleştiren aşırı etkin bir Tn5 transpozazla çalışır; Adey'e göre bu enzim de nükleozoma sarılı DNA'yı güçlükle keser. Haritaların okunuşu genom yöntemlerine ayrılan derslerde gelecek.

Okuyucu ve yazıcı

Pazartesi kuyrukların enzimlerce işaretlenebildiğini görmüştük. Heterokromatinin en bilinen işareti H3 kuyruğunun dokuzuncu lizinine eklenen üç metil grubudur (H3K9me3). Wikipedia'nın HP1 maddesine göre bu ailenin proteinleri baştaki bir kromodomain (chromodomain) ile sondaki bir kromoshadow alanından (chromoshadow domain) kurulur, aralarında esnek bir menteşe bulunur. Kromodomainin H3K9me3'lü kuyruğu tanıması ailenin belirleyici özelliğidir. Allshire ile Madhani'nin 2018 derlemesi kromoshadow alanını bir dimerleşme alanı diye tarif eder: iki HP1 bu uçlarından eşleşir ve başka heterokromatin proteinlerinin tutunduğu bir platform kurar.

Wikipedia ile Elgin ve Reuter'in 2013 derlemesi proteinin ilk kez 1986'da sirke sineğinde tarif edildiğini yazar. Derlemeye göre sinekteki HP1a, işaretli kuyruğu kromodomainiyle bağlarken kromoshadow alanıyla bu işareti koyan SU(VAR)3-9 enzimini tutar; derleme bu ikiliyi bir "bellek çekirdeği" sayar. Enzimin memelideki karşılığı SUV39H1'dir; Wikipedia'nın HP1 maddesi de HP1β'nın bu enzimle etkileştiğini yazar.

Yayılma bu eşleşmeden doğar. Allshire ile Madhani'ye göre işaretli nükleozomu tanıyan okuyucu, işaretleyen yazıcıyı getirir; yazıcı komşu nükleozoma aynı işareti koyar, yeni işaret yeniden tanınır. Derleme halkayı alanları genişleten bir pozitif geri besleme sayar. Yazıcı ve silici enzimlerin kendisini Histon Metilasyonu dersi işleyecek.

Halkanın her turda bir sonraki nükleozoma p olasılıkla geçtiğini, 1 − p olasılıkla durduğunu varsayalım. Ortalama yayılma uzunluğu 1 ÷ (1 − p) nükleozom olur. Kurgu bir p = 0,9 için 10 nükleozom, yani 200 baz çiftilik tekrarla yaklaşık 2 kilobaz eder; p = 0,99 için 100 nükleozom, 20 kilobaz.

Damla mı, çökmüş yumak mı

Biyomoleküler kondensat ve faz ayrışması fikrini Hücresel Bölmelendirme dersinde tanımış, Stres Granülleri dersinde sitoplazmada sınamıştık. 2017'de iki ekip heterokromatini bu çerçeveye taşıdı. Larson ve arkadaşları insan HP1α'sının deney tüpünde, N-ucundaki uzantı fosforillenince ya da DNA'ya bağlanınca damla kurduğunu, nükleozom ve DNA'nın damlalarda toplandığını gösterdi. Strom ve arkadaşları sinek HP1a'sının erken embriyoda sıvı özellikleri taşıyan odaklar oluşturduğunu bildirdi. Erdel ve arkadaşlarının 2020 çalışması ise fare fibroblastlarında HP1'in canlı hücrede zayıf damla kurduğunu, odak boyutunun HP1'den bağımsız kaldığını buldu ve odakları çökmüş bir polimer yumağına benzetti.

Sinek gözündeki yamalar

Fotoğrafın hikâyesini hem Elgin ile Reuter hem Wikipedia'daki konum etkisi alacalanması maddesi 1930'a götürür: Hermann Muller X ışınıyla mutasyon tararken gözü kırmızı ve beyaz yamalı sinekler buldu. Sorumlu yeniden düzenleme In(1)w^m4 adlı bir ters dönmeydi (inversion): kırıklardan biri sentromer çevresindeki heterokromatine düştü, göz rengini veren white geni ise heterokromatinin yanına taşındı. Derlemeye göre gen kırığa yaklaşık 25 kilobaz uzaktaydı ve sessiz durum komşu ökromatinin yaklaşık 200 kilobazını kaplayabiliyordu. 200.000 ÷ 200 = 1000 nükleozom; yukarıdaki basit model bunun için p ≈ 0,999 ister.

Ruhsar Hanım'ın cevabı buradan gelir. Elgin ile Reuter kırmızı fasetlerin varlığını genin hasar görmediğinin kanıtı sayar. Yamalar susturmanın olasılıklı işlediğini gösterir; HP1 ve SU(VAR)3-9 da alacalanmayı bastıran mutasyonların taranmasıyla bulundu.

Sağlam kromozomda heterokromatin neden yürüyüp gitmez? Elgin ile Reuter, alacalanma yaratan yeniden düzenlemelerin aradaki bir bariyeri ya da tampon bölgeyi kaldırmış göründüğünü yazar. Wikipedia'nın yalıtıcı (insulator) maddesi bu dizilerin bir türünü bariyer yalıtıcı diye ayırır ve komşu heterokromatinin yayılmasını önlediğini anlatır; omurgalılardaki ilk örnek tavuk beta-globin bölgesinden gelir.

Bölünmeden geçen sessizlik

Allshire ile Madhani, DNA kopyalanırken eski H3–H4 dörtlülerinin iki kardeş zincire rastgele dağıldığını, boşlukların serbest histonlardan kurulan yeni nükleozomlarla dolduğunu yazar. Eski işaretleri tanıyan okuyucu–yazıcı ikilisi yeni komşuları da işaretleyebilir; durum, DNA dizisine bakmadan kendini yeniden yazar.

2015'te iki ekip bunu fisyon mayasında sınadı. Ragunathan ve arkadaşları dışarıdan başlattıkları bir H3K9 metilasyonu alanının, başlatıcı kaldırıldıktan sonra birkaç mitoz ve mayoz boyunca kalıtıldığını gösterdi. Audergon ve arkadaşları yabanıl hücrelerin işareti hızla sildiğini, silici olduğu düşünülen Epe1 proteini yokken ise susmanın birçok bölünme boyunca sürdüğünü buldu.

Epigenetiğin tanımı ve DNA metilasyonunun bu belleğe katkısı epigenetik modülünde açılacak.

Dişide susan X

Fakültatif heterokromatinin en büyük örneği bir kromozomun tamamıdır. Wikipedia ve Europe PMC kaydı süreci Mary Lyon'un 1961'de Nature'da çıkan fare makalesine bağlar. OpenStax'in biyoloji kitabına göre dişi memeli embriyosu birkaç bin hücreyken her hücrede X'lerden biri sıkıca yoğunlaşıp susar; seçim rastgeledir, ama bir kez yapılınca o hücreden türeyen bütün hücreler aynı X'i susturur.

Lamdaki yeşil bulut bu sürecin izidir. Wikipedia'nın XIST maddesine göre bu kodlamayan RNA susacak X'ten yazılır, çekirdekte kalır ve kendi kromozomunu kaplar; X inaktivasyonu maddesi genlerin kaplamanın hemen ardından sustuğunu yazar. Allshire ile Madhani'nin aktardığına göre XIST susmayı kurmak için gereklidir, gelişimin ilerisinde kaldırıldığında ise susma sürer: başlatıcı gider, bellek kalır.

Bulutun altındaki lekeye gelince, Wikipedia'nın Barr cisimciği maddesi ve PubMed kaydı, Murray Barr ile Ewart Bertram'ın 1949'da Nature'da dişi ve erkek sinir hücrelerinin çekirdekleri arasındaki bir farkı bildirdiğini gösterir. OpenStax yoğunlaşmış pasif X'e Barr cisimciği der; Wikipedia'ya göre leke çoğunlukla zarfın kenarında durur.

Mozaik dışarıdan da görünür. OpenStax ile Wikipedia, X'teki bir tüy rengi geninin iki biçimini taşıyan dişi kedilerin kaplumbağa kabuğu (tortoiseshell) desenini her bölgedeki öncül hücrenin hangi X'i susturduğuna bağlar; OpenStax'e göre tek X'li erkek kedide bu desen görülmez.

Yamanın oranını kaç öncül hücreden kurulduğu belirler. Golgi Organizasyonu dersinde yığınların yavru hücrelere dağılımını yazı turayla hesaplamıştık. Aynı mantıkla 16 öncülden kurulan kurgu bir dokuda annenin X'ini susturan hücre sayısının ortalaması 8, standart sapması √(16 × ½ × ½) = 2'dir: pay yüzde 50 ± 12,5. Öncül 4 olsaydı sapma yüzde 25'e çıkar ve dördünün de aynı X'i seçme olasılığı 2 × (½)⁴ = 0,125 olurdu. Wikipedia gerçek dokularda bu dağılımın sık sık eşitlikten saptığını (çarpık X inaktivasyonu) yazar. X'e bağlı bazı kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı kadınlardaki tablonun değişkenliğine bu mozaik de katkıda bulunur. Seçimi kuran mekanizmanın ayrıntısı X Kromozomu İnaktivasyonu dersine kalacak.

Lam mikroskoptan alınırken

Aybars defterine üç hesap geçiriyor: "10 dk: %37 ve %90 → hız farkı ≈ 10 kat", "yayılma ≈ 1 ÷ (1 − p)", "16 öncül → %50 ± 12,5". Altına yamalı bir göz çizip yanına "gen yerinde, paketi başka" diye not düşüyor.

Ruhsar Hanım lamı kaldırmadan önce bir çekirdeğe yeniden odaklanıyor. Yeşil bulutun dışında, çekirdek boyasını sıkı tutan birkaç küçük nokta daha var. "Bunlar her hücrede bulunur, kadında da erkekte de," diyor. "Kromozomun beli ve uçları. Cuma sıra onlarda."

Kendini sına

1. Kurguda kapalı bölgenin hız sabiti 0,02/dk olsaydı on dakikada sağlam kalan pay ne olurdu? Açık bölgeyle aradaki oran nasıl değişirdi?
2. HP1'in kromodomaini sağlam, kromoshadow alanı bozuk olsaydı yayılma hakkında ne beklerdin? Cevabını dimer ve yazıcı enzim üzerinden kur.
3. Basit yayılma modelinde ortalama 50 kilobazlık bir sessiz alan hangi p değerini gerektirir?
4. Alacalı gözlü sinekte white geni silinmiş olsaydı tamamen kırmızı gözlü sinekler geri elde edilebilir miydi? Neden?
5. 8 öncüllü bir dokuda annenin X'ini susturan hücre payının standart sapması kaçtır? Erkek kedide kaplumbağa kabuğu deseni neden beklenmez?

Bir sonraki derse köprü

Koyu bölgelerin bir kısmı hücreden hücreye değişir; susan X bunun örneğiydi. Bir kısmı ise her hücrede aynı yerde durur. Sentromer ve Telomer dersi bu iki yeri soracak: bölünmede kromozomun iplere tutunduğu bel bölgesi, alfa uydu (alpha satellite) tekrarları ve CENP-A'lı nükleozomlar üstünde kinetokoru nasıl kurar? Kromozom uçlarındaki TTAGGG tekrarları her kopyalamada neden biraz kısalır, telomeraz bu uç kopyalama sorununa ne yapar ve iki bölgenin de heterokromatinle sarılı olması işlerine ne kazandırır?