Histonlar ve Nükleozom

Asitte çözünen proteinler

Martın ilk pazartesisi. Vadideki sis dokuza doğru dağılmış. Ruhsar Hanım cuma akşamı masaya bıraktığı makaranın yanına buzla dolu bir kova koymuş; içinde dana timüsünden ayrılmış çekirdekler var, üstlerine soğuk sülfürik asit dökülüp gece boyunca soğuk odada çalkalanmış.

Aybars tüpü santrifüjden çıkarıyor: dipte beyaz, lifli bir çökelti, üstte berrak bir sıvı. "DNA dipte kaldı," diyor Ruhsar Hanım, "proteinlerin çoğu da onunla. Asitte çözünenler üstte." Sıvıdan bir damla öğleye doğru jele yükleniyor. Boyanınca şeritte beş bant beliriyor: dördü alt kısımda birbirine çok yakın, beşincisi biraz yukarıda, tek başına.

Öğleden sonra Ruhsar Hanım'ın önceden arıttığı histon çiftleri ve 147 baz çiftilik bir DNA parçası masaya geliyor. Aybars parçayı bir tüpte yalnız H3–H4 ile, birinde H3–H4 ve H2A–H2B ile, birinde de yalnız H2A–H2B ile buluşturuyor. Akşama doğru dört örnek yan yana yürütülüyor. Çıplak DNA en uzağa gidiyor; H3–H4 eklenenin bandı geride, dört histonu birden görenin bandı daha da geride. Yalnız H2A–H2B ile karıştırılan DNA çıplak DNA'nın hizasında, üstünde soluk bir bulanıklıkla duruyor.

"Sıra fark ediyor mu?" diye soruyor Aybars. Ruhsar Hanım: "Makaranın da bir kurulma sırası var."

Makaranın içi

Kromatin Organizasyonu dersinde boncukların sayısını ve DNA'yı hangi yükle tuttuklarını hesaplamıştık; boncuğun içi kapalı kalmıştı. Şimdi o içe gireceğiz: histonların dizisine, ortak kıvrımlarına, kurulma sıralarına, kuyruklarına ve yerlerine geçen çeşitlerine.

Metin

Bazik proteinler

Asidin seçiciliği yükten gelir. Sidoli ve arkadaşlarının 2016 tarihli yöntem makalesi, histonların çekirdeğin en bazik proteinleri arasında olduğunu ve bu yüzden buz gibi sülfürik asitle çıkarılabildiğini yazar; 2023 tarihli başka bir yöntem çalışması da küçük ve bazik yapılarının onları asitli ortamda çözünür kıldığını aktarır. Lizin ile argininin proton tutan yan zincirlerini Proteinlerin Tampon Rolü dersinde görmüştük.

Bazikliği dizide saymak mümkün. UniProt'taki insan H4 kaydı 103 amino asitlik bir zincir verir, NCBI'deki kayıt aynı diziyi taşır. Baştaki metiyonin olgun proteinde bulunmaz; kalan 102 kalıntının 11'i lizin, 14'ü arginin: 25 artı yüklü kalıntı, kabaca her dört kalıntıdan biri. Eksi yüklü aspartat ve glutamat yalnız 7. Histidini ve uçları saymayan kaba bir net yük 25 − 7 = +18 eder. Artıların bir bölümü zincirin başında toplanır: ilk yirmi beş kalıntıda dokuz lizin ve arginin var.

Bantların sırasını kütle verir. Aynı kayıtlardaki dizilerden hesaplanan kütleler H4 için yaklaşık 11,4, H2B için 13,9, H2A için 14,1, H3 için 15,4 kilodaltondur. Bağlayıcı histon H1'in bir türü olan H1.4 ise 21,9 kilodalton taşır; yukarıda tek başına kalan bant onunkiydi.

Ortak kıvrım

Arents ile Moudrianakis 1995'te dört çekirdek histonun dizilerinin birbirine az benzediğini, ama üç boyutta ortak bir kıvrım paylaştıklarını yazdı. Kıvrıma adını aynı ekip 1991'de, histon oktamerini 3,1 ångström çözünürlükle çözdükleri kristal yapıda koymuştu. Oktamerdeki kopya sayısını da McGinty ile Tan'ın 2015'te çıkan derlemesi bu yapıya dayandırır.

McGinty ile Tan düzeni açar: kısa α1 ve α3 sarmalları uzun α2'nin üstüne geri katlanır. Her kıvrım tamamlayıcı bir eş arar; H3 H4'le, H2A H2B'yle eşleşir ve iki zincir birbirine geçerek hilal biçimli bir ikili kurar. Arents ekibinin 1991 makalesi bu kenetlenmeyi "el sıkışma" (handshake) motifi diye tarif etmişti. Tek bir kıvrım yarım bir yapıdır.

Kurulma sırası

İkililer çekirdeği nasıl kurar? Arents ekibinin 1991 yapısı oktameri üç parçalı bir yapı olarak gösterdi: ortada iki H3–H4 ikilisinden oluşan bir dörtlü, iki yanında birer H2A–H2B ikilisi. McGinty ile Tan'a göre dörtlüyü iki H3 arasındaki dört sarmallı bir demet kenetler; her H2A–H2B ikilisi de H4 ile H2B'nin kurduğu benzer bir demetle dörtlünün bir yarısına oturur.

Hücredeki sıra bu mimariyi izler. Zhang, Feng ve Li'nin 2020 derlemesi H3–H4'ün önce dörtlü hâlinde DNA'ya yerleştiğini, iki H2A–H2B ikilisinin ardından hızla eklendiğini anlatır. Prado ile Maya'nın 2017 derlemesi de yeni kopyalanan DNA'nın aynı adımlarla paketlendiğini yazar. Yalnız dörtlünün sardığı ara ürüne tetrazom (tetrasome) denir. Jeldeki ilk kayma buydu; H2A–H2B ise dörtlü olmadan düzenli bir parçacık kuramadı.

Bu sıra kendiliğinden işlemez. Wikipedia'nın nükleozom maddesine göre oktamer DNA yokken ancak çok yüksek tuzda kararlı kalır. Şaperon Proteinleri dersinde katlanan zincire eşlik edip yanlış yapışmayı önleyen proteinleri görmüştük; histonların da kendi eşlikçileri, histon şaperonları vardır. Zhang ve arkadaşlarına göre Asf1 yeni yapılmış H3–H4 ikilisini tutar, dörtlü kurmasını engeller ve onu CAF-1 gibi başka şaperonlara devreder; derleme Asf1'in bu ikilinin porlardan çekirdeğe taşınmasına yardım ettiğini de yazar. H2A–H2B tarafında Gill ekibinin 2022 çalışması NAP ailesinin bu ikiliyi bağladığını, Wikipedia'nın nükleozom maddesi ise NAP-1'in onu nükleozoma yüklediğini anlatır.

Kristaldeki makara

Luger ve arkadaşları 1997'de nükleozom çekirdek parçacığının kristal yapısını 2,8 ångström çözünürlükle yayımladı. Protein Veri Bankası'ndaki 1AOI kaydı yapıyı 146 baz çiftilik bir DNA parçası ve dört çekirdek histonla verir. McGinty ile Tan bu yapıyı nükleozomun ilk atomik görüntüsü sayar ve kurbağa histonlarıyla elde edildiğini belirtir. Kromatin Organizasyonu dersinde bu yapıdan yalnız DNA'nın attığı tur sayısını almıştık.

Dört kütlenin toplamının iki katı 2 × (14,1 + 13,9 + 15,4 + 11,4) ≈ 110 kilodalton eder. Nükleotitler dersindeki baz çifti başına 618 daltonla 147 baz çifti 147 × 618 ≈ 90.800 dalton, yani yaklaşık 91 kilodaltondur. Toplam 200 kilodaltona yaklaşır; McGinty ile Tan da parçacığı yaklaşık 200 kilodaltonluk bir disk diye tarif eder. Kütlece protein DNA'dan biraz ağırdır: 110 ÷ 91 ≈ 1,2.

DNA makaraya her noktasından değmez. Wikipedia'nın histon oktameri maddesine göre sarılan DNA küçük oluğunu 14 ayrı yerde oktamere çevirir. 2008 ve 2024 tarihli iki çalışma da 14 temas noktası sayar ve çoğunda bir arginin yan zincirinin oluğa girdiğini yazar. DNA Çift Sarmalı dersinde bir sarmal dönüşünün çözeltide 10,5 baz çifti dolayında olduğunu görmüştük. 147 ÷ 14 ≈ 10,5: küçük oluk her dönüşte bir kez makaraya bakar. McGinty ile Tan da aralığı on baz çifti dolayında verir.

Wikipedia'nın nükleozom maddesine göre bağların çoğu omurganın fosfatlarına kurulduğu için nükleozom hemen her diziye oturabilir. McGinty ile Tan bazı baz adımlarının oluğun içe baktığı noktalarda daha sık bulunduğunu ekler: makara bazı dizileri yeğler, yine de neredeyse hepsine sarılabilir.

Kuyruklar

McGinty ile Tan çekirdek parçacığından on esnek kuyruk çıktığını yazar: sekiz histonun her birinden bir N-ucu, H2A'dan ek iki C-ucu. Wikipedia'nın histon oktameri maddesi bu uzantıları yapısız diye tarif eder; nükleozom maddesine göre esneklikleri yüzünden kristalde büyük ölçüde görünmezler. Luger ekibinin özeti N-ucu kuyrukların DNA turlarının üstünden ve arasından geçip komşu parçacıklara uzandığını aktarır. H4'ün başında saydığımız artılar bu kuyruktadır.

Sarılma kuyruksuz da yürür: histon oktameri maddesine göre tripsinle kesildiklerinde DNA nükleozoma sıkı bağlı kalır. Kuyruklar değiştirilebilir uçlardır; aynı madde ile histon maddesi, kuyruklardaki lizin, arginin ve serinlerin enzimlerce kimyasal olarak işaretlenebildiğini yazar. Kromatin Organizasyonu dersinde bu işaretlerden birinin, asetilasyonun, yükü nötrleştirdiğini görmüştük. İşaretleri kimin koyup kaldırdığını epigenetik modülünde Histon Asetilasyonu ve Histon Metilasyonu dersleri işleyecek.

Yerine geçen çeşitler

Beş bant tablonun tamamı değildir. Talbert ile Henikoff'un 2021 derlemesine göre replikasyona bağlı, yani kanonik histonlar çok sayıda genden yapılır ve mRNA'ları intronsuzdur; varyantlar ise çoğunlukla tek bir genden, hücre döngüsü boyunca yapılır ve sökülen histonların yerine geçer. Sokolova, Sarkar ve Tan'ın 2023 derlemesi kanonik histonların gen kümelerinden, döngüye bağlı yapıldığını yazar; Wikipedia'nın histon maddesi bu yapımı DNA'nın kopyalandığı S evresine bağlar.

H3.3 en küçük farkla başlar. Sokolova ve arkadaşları onun kanonik H3'le %96 özdeş olduğunu, yalnız beş amino asitte ayrıldığını ve bu beş kalıntının H3.3'ü taşıyan şaperonun tanıdığı yer olduğunu yazar. UniProt'taki iki insan dizisi karşılaştırılınca da 135 olgun kalıntıda beş fark çıkar: 130 ÷ 135 ≈ %96. Talbert ile Henikoff'a göre CAF-1 replikasyonda kanonik H3'ü bütün genoma dağıtırken HIRA adlı şaperon transkripsiyonda kaybolan nükleozomları H3.3 ile yeniler; H3.3 böylece etkin kromatini işaretler. H2A.Z için aynı derleme genlerin 5' uçlarını, Sokolova ekibi promotörün hemen yanındaki nükleozomu gösterir.

CENP-A en uzak akrabadır. Talbert ile Henikoff onu H3 varyantlarının en farklısı sayar, hayvanlarda sentromere özgü olduğunu ve kinetokorun üstüne kurulduğu temel protein olduğunu yazar; Wikipedia'nın CENP-A maddesi de sentromerin yerini bu proteinin belirlediğini anlatır. Sentromerin bölünmedeki işini Sentromer ve Telomer dersi açacak. MacroH2A'da ise derlemeye göre histon katlanmasına bir bağlayıcıyla makro alanı denen ayrı bir bölge eklenmiştir; UniProt kaydındaki 369 kalıntı, sıradan bir H2A'nın 130 kalıntısının neredeyse üç katıdır.

Canlılar arasında

Wikipedia'nın H4 maddesine göre bezelye ile ineğin H4 dizileri 102 konumun yalnız ikisinde ayrılır; 2013 tarihli bir derleme aynı sayıyı bezelye ile dana timüsü için verir ve 1969'daki dizi karşılaştırmasına dayandırır. Bir bitki ile bir memeli arasında bu, 100 ÷ 102 ≈ %98 özdeşlik demektir. Talbert ile Henikoff dört çekirdek histonu bilinen en korunmuş proteinler arasında sayar. Wikipedia'nın H4 maddesi bir açıklama önerir: işlev zincirin hemen her amino asidini kullandığı için değişikliklerin çoğu zararlıdır.

Kıvrımın kökü ökaryotlardan eskidir. Arents ile Moudrianakis 1995'te histon katlanmasını arkebakterilerden memelilere uzanan canlılarda bulduklarını yazdı. Wikipedia'nın histon maddesine göre arkelerin çoğunda tek tip birimden kurulan, H3–H4'e benzeyen ikililer DNA'yı nükleozoma benzer biçimde sarar; Talbert ile Henikoff da histon katlanmalı proteinleri üç hücresel domainde sayar. Prokaryot ve Ökaryot Hücre dersinde arkeleri ayrı bir domain olarak tanımıştık; makaranın ilk biçimi o soyda aranıyor.

Akşam, soğuk odada

Aybars ikinci jelin fotoğrafını defterine yapıştırıyor, şeritlerin yanına "çıplak", "dörtlü", "sekizli", "tutunamadı" yazıyor. Altına üç satır: "110 protein + 91 DNA ≈ 200 kilodalton", "147 ÷ 14 ≈ 10,5", "H4: 25 artı, 7 eksi".

Ruhsar Hanım asit tüpünün dibindeki beyaz çökeltiyi ışığa tutuyor. "Bunların hepsi aynı makaralara sarılıydı," diyor, "ama aynı sıkılıkta değil. Çarşamba sıkı sarılanla gevşek sarılan arasındaki farka ve o farkı neyin koruduğuna bakacağız."

Kendini sına

1. Histonlar neden soğuk asitte çözünür? Cevabını H4'ün lizin, arginin ve asidik kalıntı sayılarıyla kur.
2. Tek bir histon katlanması neden yarım bir yapıdır? H3'ün ve H2A'nın eşi hangisidir?
3. Yalnız H2A–H2B eklenen tüpte neden düzenli bir kayma görülmedi? Asf1'in H3–H4 ikilisinin dörtlü kurmasını engellemesi hücrede ne işe yarayabilir?
4. Nükleozom 147 yerine 145 baz çifti sarsaydı protein–DNA kütle oranı kaç olurdu?
5. Beş amino asitlik bir fark, H3.3 ile kanonik H3'ün genomda farklı yerlere gitmesini nasıl sağlayabilir?

Bir sonraki derse köprü

Makaranın parçalarını tanıdık. Aynı makaralardan kurulan ipin bazı yerlerde sıkı, bazı yerlerde gevşek durduğunu ise Kromatin Organizasyonu dersindeki kesitte görmüştük. Ökromatin ve Heterokromatin dersi bu farkın nasıl korunduğunu soracak: heterokromatin proteini HP1 metillenmiş bir H3 kuyruğunu nasıl tanır ve sessiz bölge komşu nükleozomlara nasıl yayılır? Bir gen heterokromatinin yanına taşındığında neden bazı hücrelerde susup bazılarında açık kalır; konum etkisi alacalanması (position-effect variegation) bu sınır hakkında ne söyler?