Nükleotitler

Cam çubuktaki beyaz iplik

Şubat bitmek üzere; yeni haftanın ilk günü. Karabük'te sabah vadiye inen sis, bir üniversitenin moleküler genetik laboratuvarının pencerelerini süt rengine boyamış. Ruhsar Hanım yıllardır bu odada nükleik asit ayırıyor; karşısındaki Aybars kimyadan moleküler biyolojiye geçmiş, doktorasının ikinci haftasında.

Aybars bir kavanoz rendelenmiş soğanı bulaşık deterjanı ve bir tutam tuzla ılık suda bekletip süzmüş. Süzüntünün üstüne buzdolabından çıkan alkolü, deney tüpünün duvarından yavaşça akıtıyor. İki sıvının sınırında beyaz, sümüksü iplikler beliriyor. Aybars cam çubuğu çevirince iplikler çubuğa sarılıyor.

Çubuktaki öbek tamponda çözülüp spektrofotometreye giriyor. Ekrandaki eğri 260 nanometrede bir tepe çiziyor. Elli kat seyreltilmiş örnekte soğurma 0,42, 280 nanometrede 0,23. Yanda dört küçük tüp var: üzerlerinde dATP, dGTP, dCTP ve dTTP yazıyor. Dördünün tepesi de 260 dolayında, ama hiçbiri ötekinin tam üstüne düşmüyor.

"Bu beyaz şey soğanın genleri mi?" diye soruyor Aybars. "Ve ışığı neden tam burada yutuyor?" Ruhsar Hanım dört tüpü yan yana diziyor: "İpliği bunlardan kurulmuş say. Önce parçalara bak."

Tezgâhtaki sorular

Bir nükleotidin üç parçasını, fosfatı eksik parçanın adını ve şekerdeki tek bir hidroksilin DNA ile RNA'yı nasıl ayırdığını göreceğiz. Parçaların zincire dizilişini, ekrandaki tepenin kaynağını ve bir insan hücresindeki DNA'nın ağırlığını iki hesapla bulacak, sonra aynı yapı taşlarının başka işlerine ve bir yanlış kuramın tarihine bakacağız.

Metin

Baz, şeker, fosfat

OpenStax'in biyoloji kitabı her nükleotidi üç bileşenle tanımlar: azotlu bir baz, beş karbonlu bir şeker (pentoz) ve bir fosfat grubu. Aynı yayınevinin anatomi ve fizyoloji kitabı fosfatı "bir ya da daha çok" diye yazar; Wikipedia'nın nükleotit maddesi de bir ile üç arasında fosfat sayar. Aybars'ın tüplerindeki son harfler bu sayıyı söylüyor: dATP'deki "TP" üç fosfat demektir.

Fosfat hiç yoksa molekülün adı değişir. Wikipedia'nın nükleotit maddesi bazın yalnız şekerle birleştiği yapıya nükleozit der; nükleozit maddesi aynı şeyi tersinden kurar ve nükleozitleri fosfat grubu olmayan nükleotitler diye tarif eder. Adenin ile riboz adenozini, timin ile deoksiriboz timidini verir.

İki halka, bir halka

Alkan, Alken ve Aromatikler dersinde DNA bazlarının azot taşıyan aromatik halkalar olduğunu ve adenin ile guaninin iki halkalı pürinler, sitozin ile timinin tek halkalı pirimidinler sayıldığını görmüştük. OpenStax bu tabloya bir pirimidin daha ekler: urasil. Kitaba göre DNA adenin, timin, guanin ve sitozin taşır; RNA'da timinin yerinde urasil bulunur. Anatomi ve fizyoloji kitabı aynı ayrımı timin için "yalnız DNA'da", urasil için "yalnız RNA'da" diye yazar.

Önceki modülün son vakasında üç harfli bir dizi, CAG, art arda yineleniyordu; tekrarı bölen CAA, ondan yalnız son harfiyle ayrılıyordu. O harfler bu bazların baş harfleridir. Değişen konumda guaninin yerine adenin oturmuştu ve ikisi de pürindir: iki halkalı bir baz, yine iki halkalı bir bazla yer değiştirmişti.

Asal işaretli karbonlar

Şekerin karbonları birden beşe kadar numaralanır ve bazın halkasındaki atomlarla karışmasın diye her numaraya bir kesme işareti eklenir: 1', 2', 3', 4', 5'; "bir üssü", "beş üssü" diye okunur. OpenStax bazın şekerin 1' karbonuna, fosfatın 5' karbonuna bağlandığını yazar; Wikipedia'nın maddesi aynı iki konumu verir.

Riboz ile deoksiriboz yalnız ikinci karbonda ayrılır. OpenStax'e göre ribozun ikinci karbonunda bir hidroksil grubu, deoksiribozunkinde ise yalnız bir hidrojen bulunur. Serbest Radikaller dersinde bu oksijeni koparan enzimi, ribonükleotit redüktazı, tirozin radikaliyle birlikte anmıştık.

Eksik hidroksilin bedeli

Wikipedia'nın RNA maddesi ribozdaki hidroksillerin hidroliz tepkimesinin aktivasyon enerjisini düşürerek RNA'yı DNA'dan kimyasal olarak daha kırılgan yaptığını yazar. Lemire, Rodriguez ve McIntosh'un 2016 makalesi bunun yolunu adım adım anlatır: bazik ortamda 2' hidroksil protonunu kaybeder, eksi yüklü oksijen komşu fosfata saldırır, 2',3'-halkalı bir fosfat oluşur ve zincir kopar. Aynı ekibe göre 2' hidroksili olmayan DNA bu yolla kesilemez ve yüksek pH'ta görece kararlı kalır; ekibin RNA'yı silip DNA'yı bırakan yöntemi bu farka dayanır.

Zincirin kurulması

Fosfodiester adını Karboksilik Asit ve Ester dersinde, fosfatın iki yanından birer alkole bağlandığı zar lipitlerinde duymuştuk. Nükleik asit aynı köprüyü bir şekerden ötekine kurar. OpenStax'e göre bir nükleotidin 5' karbonuna bağlı fosfat, sonraki nükleotidin şekerindeki 3' hidroksil ile ikinci bir ester bağı kurar.

Omurganın her fosfatı nötr pH'ta bir eksi yük taşır; Fonksiyonel Gruplar dersi bunu tablosuna yazmış, Kromatin Organizasyonu dersi de histonların artı yüzeyini bu yüke yaslamıştı.

Aybars'ın beyaz ipliği de bu yükün öyküsüdür. OpenStax deterjanın hücreleri açtığını ve alkolün DNA'yı çöktürdüğünü yazar. Wikipedia'nın etanolle çöktürme maddesi ayrıntıyı ekler: tuzdan gelen artı iyonlar fosfatların eksi yükünü dengeler, sudan çok daha az kutuplu olan alkol de bu yüklerin su tarafından perdelenmesini zayıflatır. Yükleri örtülen uzun zincirler çözeltide kalamaz ve birbirine dolanarak çubuğa sarılan bir öbeğe dönüşür.

Tepe 260 nanometrede

Wikipedia'nın nükleik asit nicelemesi maddesi nükleik asitlerin ultraviyole ışığı belirli bir düzenle soğurduğunu ve 260 nanometre bölgesindeki soğurmanın bazların halkalı yapısından geldiğini yazar; aynı ansiklopedinin hiperkromisite maddesi de doğal hâldeki DNA bazlarının 260 nanometre bölgesinde soğurduğunu söyler. Dört tüpün tepeleri bu yüzden 260 dolayında toplanıyordu: dördünde de ışığı yutan bir halka var, ama halkaların hiçbiri ötekinin aynısı değil.

Elektron Taşıyıcılar dersinde Beer–Lambert yasasını NADH'ın 340 nanometredeki soğurmasıyla kurmuştuk. Burada dönüşüm katsayısı doğrudan kütle cinsinden verilir. Wikipedia'nın maddesi ve 2016'da Chemistry Central Journal'da yayımlanan bir plazmit niceleme çalışması, bir santimetrelik küvette 1,0 soğurmanın mililitrede yaklaşık elli mikrogram çift zincirli DNA'ya karşılık geldiğini yazar. Aybars'ın seyreltik örneğinde soğurma 0,42 idi: 0,42 × 50 = 21 mikrogram/mililitre. Örnek elli kat seyreltildiği için özütün kendisi 21 × 50 = 1.050 mikrogram/mililitre, yani mililitrede bir miligramın biraz üstündedir.

İkinci okuma saflık hakkındadır. Wikipedia'ya göre proteinler, özellikle aromatik amino asitleri yüzünden, 280 nanometrede soğurur; saf DNA'da 260/280 oranı 1,8 dolayında, saf RNA'da 2,0 dolayındadır. Plazmit çalışması iyi arıtılmış çift zincirli DNA için 1,8 ile 2,0 arasını kabul eder. Aybars'ın oranı 0,42 ÷ 0,23 ≈ 1,83. Sayının bir sınırı var: Wikipedia oranın nükleik asit içindeki proteine pek duyarlı olmadığını not eder. Cihaz DNA ile RNA'yı da ayırmaz; ikisinin bazları aynı bölgede soğurduğu için özütteki RNA da tepeye katılır.

Bir hücrenin DNA'sı kaç gram

Kromatin Organizasyonu dersinde diploit bir insan hücresinin DNA'sını 6,2 milyar baz çiftiyle saymıştık. Wikipedia'nın baz çifti maddesi bir DNA baz çiftine yaklaşık 618 dalton yazar; bu, mol başına 618 gram demektir. Avogadro sayısıyla: 6,2 × 10⁹ × 618 ÷ (6,022 × 10²³) ≈ 6,4 × 10⁻¹² gram, yani yaklaşık 6,4 pikogram.

Wikipedia'nın genom büyüklüğü maddesi Doležel ekibinin dönüşümünü verir: bir pikogram DNA 978 milyon baz çiftine karşılık gelir. 6,2 × 10⁹ ÷ (978 × 10⁶) ≈ 6,3 pikogram. Piovesan ve arkadaşlarının 2019 tarihli hesabı ise insan diploit çekirdek genomunu erkekte 6,41, kadında 6,51 pikogram bulur.

Aynı harfler, başka işler

Şaperon Proteinleri dersinde Hsp70'in, Ubiquitin–Proteazom Sistemi dersinde de proteazomun ATP harcadığını görmüştük. ATP de bir nükleotittir. OpenStax'in anatomi–fizyoloji kitabı onu bir riboz şekeri, bir adenin bazı ve üç fosfat grubundan kurulu diye tarif eder; DNA'ya giren dATP'den farkı şekerindeki o 2' hidroksildir. Gibbs Serbest Enerjisi dersinde uç fosfatın kopmasıyla açığa çıkan enerjiyi hesaplamıştık.

Wikipedia'nın nükleotit maddesi ailenin öteki işlerini sayar: ATP ve GTP ile enerji aktarımı, siklik AMP (cAMP) gibi halkalı nükleotitlerle hücre içi sinyal ve NAD⁺, FAD, koenzim A gibi kofaktörler. OpenStax'in hücre iletişimi bölümü cAMP'nin adenilil siklaz adlı enzimle ATP'den yapıldığını ve bir kinazı etkinleştirdiğini anlatır; taşıyıcı bozukluğu vakasında klorür kanalını açan uyarı da hücre içi cAMP'yi yükseltiyordu. Wikipedia'nın NAD maddesi bu molekülün adını fosfatları üzerinden birleşmiş iki nükleotitten aldığını yazar: birinin bazı adenin, ötekininki nikotinamittir. Elektron Taşıyıcılar dersinde yalnız nikotinamit ucuna bakmıştık; öbür ucunda bir adenin nükleotidi durur. Bu kofaktörlerin her biri Nükleotitler ve Koenzimler modülünde ayrı bir ders olarak işlenecek.

İrinden dört harfe

Wikipedia'nın Miescher maddesi ve Ciurea ekibinin 2024 derlemesi, Friedrich Miescher'in 1869'da Tübingen'de Felix Hoppe-Seyler'in laboratuvarında, cerrahi sargılardaki irinden topladığı akyuvarların çekirdeklerinden fosforca zengin bir madde ayırdığını ve ona "nüklein" adını verdiğini anlatır. Albrecht Kossel nükleinin protein olmayan kısmına yöneldi ve onu oluşturan bazları birbirinden ayırdı. NobelPrize.org Kossel'e 1910 Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nün, proteinler ve nükleik maddeler üzerine çalışmalarıyla hücre kimyasına katkısı için verildiğini yazar; Wikipedia'nın Kossel maddesi de ödülü nükleik asitleri ayırıp tarif etmesine bağlar.

Wikipedia'nın Levene maddesi ve Sharma ekibinin 2024 makalesi, Phoebus Levene'in 1929'da DNA'daki şekerin 2' hidroksili taşımayan bir pentoz olduğunu gösterdiğini aktarır. Wikipedia'nın tetranükleotit hipotezi maddesine göre Levene DNA'nın dört bazı eşit miktarda taşıyan, aynı dörtlünün yinelendiği bir zincir olduğunu düşünüyordu; böyle bir zincir pek az bilgi taşıyabilirdi. Ciurea ekibi bu hipotezin bazların gerçek oranları ölçülünce yıkıldığını anlatır. O ölçümün ne gösterdiğini Antiparalellik ve Baz Eşleşmesi dersi işleyecek. Wikipedia'nın maddesi sonucun yönünü de yazar: dörtlü düzen düşünce, bazların değişken sırasının bilgi saklayabileceği yolu açıldı.

Pazartesi akşamı tezgâh

Aybars defterine köşeleri 1'den 5'e asal işaretle numaralanmış bir beşgen çiziyor. 1' köşesine çift halka çizip "pürin", yanına tek halka çizip "pirimidin" yazıyor. 5' köşesine üç daire diziyor, ikisinin üstünü çizip "DNA'da bir tane kalır" diye ekliyor. 2' köşesine kırmızı kalemle "OH → RNA, H → DNA" yazıyor. Sayfanın altında iki hesap: "1.050 mikrogram/mililitre, oran 1,83" ve "6,4 pikogram".

Ruhsar Hanım cam çubuğu ışığa tutuyor. Beyaz öbekte ne bir sarmal ne bir düzen seçiliyor. "Parçaları biliyoruz," diyor. "Çarşamba iki ipliğin birbirine nasıl sarıldığına bakacağız. Ve bunu kimin, hangi fotoğraftan çıkardığına."

Kendini sına

1. Bir şişenin etiketinde "deoksisitidin" yazıyor. Bu bir nükleozit mi, nükleotit mi? Hangi baz ve hangi şekeri taşır, nükleotit olması için ne eklenmelidir?
2. Bir RNA örneği ile bir DNA örneği aynı bazik çözeltide bekletiliyor. Hangisi kırılır, kırılma şekerin hangi karbonundan başlar ve neden?
3. Bir DNA çözeltisi yirmi kat seyreltildiğinde bir santimetrelik küvette 0,30 soğurma veriyor. Seyreltilmemiş çözeltinin derişimi mililitrede kaç mikrogramdır? 260/280 oranı 1,6 çıksaydı neyi düşünürdün ve bu oranın neyi göstermediğini söyle.
4. ATP, dATP ve cAMP'yi şeker, baz ve fosfat sayısı bakımından karşılaştır. Hangisi DNA zincirine girebilir?
5. Tetranükleotit hipotezi doğru olsaydı, DNA'nın kalıtsal bilgi taşıyıp taşıyamayacağı konusunda ne beklerdin?

Bir sonraki derse köprü

Tek bir zincirin parçalarını ve omurgasını kurmuştuk; Aybars'ın çubuğundaki öbekte ise iki iplik vardı. DNA Çift Sarmalı dersi o iki ipliği soracak: iki zincir birbirine nasıl sarılır ve sarmalın yüzeyinde büyük ve küçük oluk denen iki farklı genişlikteki yiv nasıl oluşur? Rosalind Franklin'in X ışını kırınım görüntüsü, Fotoğraf 51, bu modele ne söylemişti; Watson ile Crick 1953'te hangi verilerden yola çıktı? Bir tam sarmal dönüşüne kaç baz çifti sığar?