Stres Granülleri

Otuzuncu dakikada yüzlerce nokta

Şubatın ikinci haftası, çarşamba. Ilgın'ın ısıtmalı tabladaki hücrelerinde G3BP1 adlı RNA bağlayıcı protein yeşil bir floresan etiket taşıyor. Stres yokken ekranda sitoplazmanın her yerine yayılmış soluk bir yeşil var. Ilgın dört kaba oksidatif stres yaratan bir tuz ekliyor. Otuzuncu dakikada üç kapta sitoplazma parlak noktalarla dolmuş; çekirdeğin içi karanlık kalmış.

Dördüncü kaba tuzla birlikte ribozomu mesajcı RNA'nın üstünde donduran bir kimyasal da girmiş. Orada yeşil sis düz kalmış. Aynı kimyasal noktaları kurulmuş üçüncü kaba sonradan damlatılınca noktalar bir saatte sönüyor, oysa tuz hâlâ besiyerinde.

İlk iki kaptan tuz yıkanıyor. Birincide noktalar iki saatte kayboluyor. İkinci kapta Hsp70'in işini durduran bir madde var ve aynı saatte hücrelerin çoğu hâlâ noktalı. Seniha Hanım ekrandaki tek bir noktanın üstüne bir mikrometre çaplı bir daire çizip lazeri açıyor; nokta kararıyor ve dört saniye sonra yarı parlaklığına dönmüş oluyor.

"Pazartesi baktığımız lifler günlerce bekliyordu," diyor Ilgın. "Bunun içi dört saniyede yenileniyor. Bu bir yığın mı, bir damla mı?"

Mekanizma

Ribozomdan düşen mesaj

Protter ile Parker'ın 2016 derlemesi stres granüllerini, çeviri başlangıcında takılıp kalmış, çevrilmeyen mesajcı RNA–protein paketlerinin toplandığı yapılar diye tanımlar. Wikipedia'nın stres granülü maddesi tetikler arasında ısıyı, oksidatif ve ozmotik stresi sayar, içerikte G3BP1, G3BP2, TIA-1 ve küçük ribozom alt birimini gösterir, boyu 0,1 ile 2 mikrometre arasında verir. Wheeler ve Parker'ın ekibi 2016'da granüllerin stresin on üçüncü dakikası dolayında görünmeye başladığını ölçtü.

Tetik çoğunlukla çevirinin ilk adımıdır. Katlanmamış Protein Yanıtı dersinde PERK'in eIF2 adlı başlatıcının α alt birimini fosforladığını ve mesajların çoğunun çevirisinin yavaşladığını görmüştük. Kedersha ve Anderson'ın ekibi 1999'da granül kurulmasının tam da bu fosforlanmayla başladığını gösterdi: fosforlanmış hâli taklit eden bir eIF2α granül kurdurdu, fosfat alamayan biçimi kurulmayı engelledi. eIF2α'yı fosforlayan öteki kinazlar Entegre Stres Yanıtı dersinde ele alınacak. Mazroui ve Pelletier'nin ekibi 2006'da ikinci bir kapı buldu: mesajı ribozoma yükleyen sarmal çözücü eIF4A engellenince granüller eIF2α fosforlanmadan da kuruluyordu. Wikipedia iki yolu birlikte anar.

Dördüncü kabın sessizliğini Kedersha'nın ekibi 2000'de açıkladı. Mesajı ribozomlara bağlı tutan bir ilaç granül kurulmasını engelledi ve kurulmuş granülleri stres sürerken bir saat içinde çözdü; ribozomları mesajdan koparan bir başkası granülleri büyüttü. Ekip iki havuzun dengede olduğunu önerdi. Mollet ve Weil'in ekibi 2008'de tek tek mesajları izleyip granülde yaklaşık bir dakika kaldıklarını, duran mesajların çoğunun granül dışında beklediğini buldu.

G3BP1: kapalı bir anahtar

Guillén-Boixet ve Franzmann'ın ekibi 2020'de G3BP'nin stressiz hücrede kendi üstüne kapanmış durduğunu gösterdi: düzensiz asidik uzantıları arjininden zengin bölgesine yapışıp onu örter. Ribozomlardan salınan açık mesajlar bu iç bağı yener; açılan G3BP molekülleri RNA üzerinden kümelenir. Yang ve Taylor'ın ekibi aynı yıl G3BP1'i bir protein–RNA ağının merkez düğümü olarak tarif etti; hücredeki serbest RNA derişimi yükselince bu anahtar toplanmayı başlatır, üç düzensiz bölgesindeki fosforlanmalar da eşiği ayarlar. Kedersha ekibinin 2016 çalışmasında G3BP1 ile G3BP2'den yoksun hücreler eIF2α fosforlanmasına granülle karşılık veremedi, ama şiddetli ısıda ve ozmotik streste kurabildi. Protter ile Parker da ozmotik streste G3BP'nin gerekmediğini yazar.

Biyomoleküler kondensat terimi Hücresel Bölmelendirme dersinde tanımlanmıştı; stres granülü bu ailenin sitoplazmada stresle açılıp kapanan bir üyesidir. Bir mesajcı RNA uzun bir zincirdir ve üstünde birçok proteinin tutunabileceği yer vardır; G3BP ve ortaklarının her biri de birden çok RNA ve protein tutar. Böyle çok değerli, tek tek zayıf bağlar bir ağ kurar ve bir eşik derişimi aşılınca ağ çevresinden ayrı bir faza çekilir.

Sıkı çekirdek, akan kabuk

Jain ve Parker'ın ekibi 2016'da granüllerde arıtılabilen kararlı çekirdekleri saran seyrek, hızla değişen bir kabuk bildirdi; kurulmanın da dağılmanın da ATP harcayan düzeneklere bağlı olduğunu gösterdi. Wheeler ekibine göre çekirdekler ortanca 259 nanometre boyunda, erken kurulur; çözülmede önce kabuk dağılır, sonra çekirdek temizlenir. Protter ile Parker çekirdeklerin yaklaşık 200 nanometre olduğunu ve ATP üretimi kesilince granüllerin hareketinin, birleşip bölünmesinin durduğunu aktarır.

Kedersha ekibinin 2000 deneyinde bir mikrometre çaplı ışınla ağartılan TIA-1 iki evrede geri döndü: hızlı evrede yarı süre bir saniye dolayında, yavaşta beş saniye dolayındaydı. Protter ile Parker çoğu granül bileşeninin yarı geri dönüşünün otuz saniyenin altında olduğunu, ama değişmeyen bir havuzun da bulunduğunu yazar. Nükleolus dersinde nükleofosmin bir dakika dolayında dönmüştü; stres granülü daha da çabuk tazelenir.

Zar Akışkanlığı dersindeki τ = w² ÷ 4D bağıntısını yarı dönüş süresini τ yerine koyarak kabaca kullanalım. Daire yarıçapı w = 0,5 µm, ekrandaki süre 4 saniye: D ≈ 0,25 ÷ 16 ≈ 0,016 µm²/s. BioNumbers'a göre yeşil floresan protein memeli sitoplazmasında 27 µm²/s ile yayılır; Swaminathan ekibinin sudaki 87 µm²/s değeri ve 3,2'lik göreli viskozitesi de 87 ÷ 3,2 ≈ 27 verir. Oran 27 ÷ 0,016 ≈ 1.700: granülün içi, çevresine göre üç basamak yavaş bir ortamdır. Yine de akar.

Birleşen damlalar

Kedersha ekibi stres sürdükçe noktaların büyüyüp birleştiğini gördü; Wheeler ekibi de granüllerin ilk kırk dakikadan sonra birleşmeyle irileştiğini yazar. İki eşit küre birleşince hacim ikiye katlanır, yarıçap 2^(1/3) ≈ 1,26 kat büyür; yeni yüzey eski tek yüzeyin 2^(2/3) ≈ 1,59 katıdır, iki yüzeyin toplamına oranı ise 1,59 ÷ 2 ≈ 0,79. Yüzey Gerilimi dersinde enerjiyi yüzey gerilimi ile alanın çarpımı diye kurmuştuk; birleşme bu enerjiyi yaklaşık yüzde 21 indirir.

Komşu bir damla: P-cisimciği

Kedersha ekibi 2005'te ikinci bir zarsız yapıyı granüllerle karşılaştırdı. P-cisimcikleri streste büyür, ama kurulmaları eIF2α fosforlanmasına bağlı değildir; çeviri başlatıcıları ve G3BP yalnız stres granülünde, şapka koparan enzimler yalnız P-cisimciğinde bulunur. İkisi aynı mesajı taşıyabilir ve birbirine yaslanır. Wikipedia'nın P-cisimciği maddesi bu yapıların stressiz hücrede de durduğunu yazar; adları yıkıma işaret etse de bugün mesajı yıkmaktan çok bekletmeleri tartışılıyor.

Damla katılaşırsa

Agregasyon ve Amiloid dersinde derişim ikiye katlanınca lif oluşumunun yarı süresinin 2,5 kat kadar kısaldığını görmüştük. Damla bir derişim adasıdır; içinde bir lif çekirdeği daha kolay kurulabilir. Patel ve Hyman'ın ekibi 2015'te FUS adlı düşük karmaşıklıklı bölgeli proteinin streste sitoplazmada sıvı bölmeler kurduğunu, deney tüpündeki damlalarının ise beklettikçe sıvıdan kümelenmiş bir hâle geçtiğini gösterdi; hastalarda bulunan değişimler bu geçişi hızlandırdı. Molliex ve Taylor'ın ekibi aynı yıl hnRNPA1 için damlanın kurulmasına lifleşmenin gerekmediğini, ama lifleşmenin proteince zengin damlalarda arttığını buldu. Bazı sinir sistemi hastalıklarında bu geçişin rolü araştırılıyor.

Hücre granülü nasıl dağıtır

Protter ile Parker, Şaperon Proteinleri dersindeki Hsp70'in ve ortaklarının granül çözülmesini desteklediğini aktarır. Ganassi ve Carra'nın ekibi 2016'da, Protein Kalite Kontrolü dersinde tanıdığımız kusurlu yeni zincirlerin granüllerde birikip onları anormal bir hâle ittiğini gösterdi; bu granüllerin çoğu HSPB8, BAG3 ve Hsp70'ten kurulu bir şaperon ekibinin yardımıyla dağıldı. Ekip bu gözetime granülostaz adını verdi.

Buchan ve Parker'ın ekibi 2013'te mayada granüllerin otofajiyle vakuole taşındığını gösterip sürece granulofaji dedi; memeli hücrelerinde otofaji ya da VCP adlı AAA ATPaz kısıtlanınca temizlik yavaşladı. Protter ile Parker VCP'nin granülü otofajiye yönelttiğini aynı biçimde yazar. Makrootofaji dersindeki çift zarlı kesenin bir yükü de budur, ama Ganassi ekibine göre anormal granüllerin azınlığı bu yola girer.

Üçüncü öneri ATP'yle ilgili. Patel ve Hyman'ın ekibi 2017'de ATP'nin hücredeki olağan derişiminde protein kümelerinin kurulmasını önleyip kurulmuşları çözebildiğini, yani bir hidrotrop gibi davrandığını önerdi. Wikipedia'nın hidrotrop maddesi hidrotropu, Yüzey Gerilimi dersindeki sürfaktanlardan farklı olarak misel kurmadan suyu sevmeyen molekülleri çözen bir madde diye tanımlar ve öneriye yöneltilen bir eleştiriyi aktarır: trifosfat kısmı ATP'ye güçlü bir tuzla çöktürme etkisi verir.

Modelin sınırı

• Granülün işlevi kesinleşmedi. Mateju ile Chao'nun 2022 derlemesi granülün çeviriyi düzenleyen bir yapı mı, yoksa duran mesajların kendiliğinden yığıldığı bir yan ürün mü olduğunu çözülmemiş bir soru diye tartışır; Wikipedia da bu görüşleri birlikte sayar.
• τ = w² ÷ 4D saf yayılma varsayar; granülde geri dönüşü bağlanıp çözülme hızı da belirler. 1.700 katlık oran bir mertebedir, granül içi viskozitenin ölçümü değil.
• Sıvıdan katıya geçiş çoğunlukla arıtılmış proteinle, hücredekinden yüksek derişimde gösterildi.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• "Hücre stresini dengeleyen" ya da "adaptojen" diye sunulan takviyelere ve bitkilere bu deneyler dayanak olmaz; granülün işlevi bilinmeden onu artırmanın ya da azaltmanın yararı da bilinemez.

Söndürülen daire

Ilgın defterine "w = 0,5 µm, t½ = 4 s → D ≈ 0,016 µm²/s" ve altına "2^(1/3) ≈ 1,26; yüzey %21 ↓" yazıyor. Hsp70'i durdurulmuş kabın satırını boş bırakıyor. "Bu hücreler gençti ve stresten çabuk döndüler," diyor. "Cuma aynı deneyi, dağıtan ekibin yorulduğu hücrelerde yineleyelim."

Kendini sına

1. Ağartılan dairenin yarıçapı 1 µm, yarı dönüş süresi 4 saniye olsaydı D kabaca kaç olurdu?
2. Üç eşit damla tek damla olunca yarıçap ve toplam yüzey nasıl değişir?
3. Dördüncü kapta neden hiç nokta oluşmadı; üçüncü kaptaki noktalar stres sürerken neden söndü?
4. G3BP1 ve G3BP2'den yoksun bir hücre oksidatif streste ve ozmotik streste nasıl davranır?
5. P-cisimciği ile stres granülü bileşimde ve tetikte nerede farklılaşır?

Bir sonraki derse köprü

Proteostaz ve Yaşlanma dersi şaperonları, proteazomu, otofajiyi ve granülleri tek bir proteostaz ağı olarak ele alacak. Ağın kapasitesi yaşla azalır mı? Morimoto'nun laboratuvarının C. elegans'ta erişkinliğin başında, üremeye geçişle aynı dönemde gördüğü ısı şoku yanıtı çöküşü yaşlanmayı başlatan bir neden midir, yoksa yaşlanan dokunun bıraktığı bir iz mi; o derste hangi deneyin bu ikisini ayırabildiği tartışılacak.