Agregasyon ve Amiloid

Dokuz saat boyunca düz

Şubatın ikinci haftası, pazartesi sabahı. Ilgın cuma akşamı ışık ölçere doksan altı kuyucuklu bir plaka bırakmış: arıtılmış, amiloid yapmaya yatkın kısa bir peptit, 37 °C, her kuyucukta Thioflavin T (ThT) adlı boya. Cihaz saatte bir okumuş. Ekranda üç eğri var.

50 mikromolarlık kuyucuklarda ışık dokuz saat boyunca neredeyse kıpırdamamış; sonra dik bir tırmanış başlamış, on dördüncü saatte yarı yola varmış, yirminci saatte bir düzlüğe oturmuş. 100 mikromolarlık kuyucuklar yarı yola 5,6 saatte varmış. Üçüncü sırada yine 50 mikromolar var, ama Ilgın başlarken her kuyucuğa önceki bir denemeden kalan liflerin ufalanmış kırıntısını, peptidin yüzde biri kadar, eklemiş. Bu eğrinin düz bir başı yok: ilk saatten tırmanıyor.

Kenardaki dört kuyucukta, geçen pazartesi olduğu gibi 42 °C'de on dakika ısıtılıp bulanan arıtılmış lusiferaz duruyor. Plakanın ışık saçılımı okuması onların en bulanık kuyucuklar olduğunu söylüyor, ThT ise onlarda hiç parlamamış. Seniha Hanım elektron mikroskobundan iki baskı getiriyor. Peptit kuyucuğundan alınan damlada dallanmayan, uzun iplikler var. Lusiferazınkinde biçimsiz, taneli bir yığın. Üçüncü baskı cuma günkü dördüncü kabın kesiti: çekirdeğin yanındaki noktanın içi çoğunlukla taneli, kenarında birkaç ince demet seçiliyor.

"Hepsine küme diyoruz," diyor Ilgın, "ama bu ikisi başka başka şeyler gibi duruyor."

Mekanizma

Cam ile kristal

Kümelenme, Protein Katlanması dersindeki tanımıyla, ayrı zincirlerin açık yüzlerinden birbirine tutunmasıydı. Bu tutunma iki biçim alabilir. Yoshimura ve Goto'nun ekibi 2012'de β2-mikroglobulin adlı küçük bir proteinle ikisini yan yana ölçtü ve bir benzetme önerdi: amiloid oluşumu kristalleşmeye, amorf kümelenme camlaşmaya benzer. Kristalleşme gibi amiloid de aşırı doygun bir çözeltiden, yani çözünürlük sınırını aştığı hâlde bir süre çözünmüş kalan bir çözeltiden doğar ve suyu dışlayan düzenli bir yapı kurar. Cam benzeri amorf kümeler ise gecikmesiz, hızla oluştu; ne çalkalama ne tohum onları hızlandırdı. ThT yalnız amiloidi izledi; amorf kümede ışık artmadı. Plakanın kenarındaki bulanık ama karanlık lusiferaz, kurguda camın yerini tutuyor.

Kırınımın iki çizgisi

Wikipedia'nın amiloid maddesi ile Mankar, Anoop, Sen ve Maji'nin 2011 derlemesi aynı imzayı verir: hizalanmış lifler X-ışını kırınımında 4,7 Å ve 10 Å'da iki yansıma üretir. Birincisi aynı tabakadaki komşu zincirler arasındaki uzaklıktır, ikincisi üst üste istiflenmiş tabakalar arasındaki. Siemer'in 2022 derlemesi zincirlerin de tabakaların düzleminin dikmesinin de lif eksenine dik durduğunu, paralel ve aynı hizada dizilmiş bir tabakada her zincirin ayrı bir molekülden geldiğini yazar. Elektron mikroskobunda lifler mikrometrelerce uzar, kalınlıkları on nanometre dolayındadır; kaynakların aralıkları birkaç nanometre oynar.

Protein Yapısında Zayıf Etkileşimler dersinde β-tabakada bir zincirin N–H gruplarının komşu zincirin C=O gruplarına bağlandığını görmüştük. Amiloidde o komşu aynı molekülün başka bir parçası değil, lif boyunca bir sonraki moleküldür. Bir mikrometre 10.000 Å'dur; 10.000 ÷ 4,7 ≈ 2.128 katman eder. Lif iki protofilamentten kuruluysa ve her katmanda her protofilamente bir molekül düşüyorsa, bir mikrometrelik lif 2 × 2.128 ≈ 4.255 molekül taşır. Protofilament sayısı liften life değiştiği için bu sayı bir ölçek, bir sabit değil.

Boyalar bu istifi okur. Wikipedia'nın Kongo kırmızısı ve amiloid maddeleri, boyanmış amiloidin polarize ışık altında elma yeşili bir çift kırılma verdiğini yazar. Thioflavin maddesine göre ThT'nin iki halkası çözeltide serbestçe döner ve uyarılmış hâli söner; life bağlanınca halkalar kilitlenir, floresans artar.

Hemen her zincirin gizli hâli

Chiti ile Dobson'un ekibi 1999'da hiçbir hastalıkla ilişkisi olmayan küçük bir enzimi, asilfosfatazı, trifloroetanol katılmış bir çözeltide yavaşça bekleterek amiloide çevirdi. Lifler dallanmıyor, Kongo kırmızısıyla çift kırılma gösteriyor, ThT ile parlıyordu. Ekip amiloid oluşumunun birkaç dizinin değil, uygun koşulda doğal polipeptit zincirlerinin çoğunun, belki hepsinin ortak özelliği olduğunu önerdi. Mankar ekibi bu görüşü Dobson'a dayanarak polipeptit zincirinin genel bir özelliği diye aktarır; Siemer de çapraz-β omurgadan kurulduğu için çoğu proteinin olası bir amiloid yapıcı olduğunu yazar. Yan zincirler yatkınlığı belirler, ama yapının iskeleti her zincirde bulunan omurgadır.

Gecikmenin içinde ne var

Arosio, Knowles ve Linse'nin 2015 derlemesi ekrandaki üç bölgeyi adlandırır: düz bir gecikme fazı, dönüşümün en hızlı olduğu büyüme ya da uzama fazı ve son düzlük, plato. Aktin Filamentleri dersinde aynı biçimde düz başlayıp tırmanan bir eğri görmüş, Pollard'ın baştaki bekleyişi kararlı bir tohum kurmanın güçlüğüne bağladığını okumuştuk. Amiloid için de ilk adım budur: birkaç zincir, dağılmadan büyüyebilecek kadar kararlı bir çekirdekte buluşmalıdır.

Ama gecikme yalnız bekleme değildir. Arosio ekibi üç fazın hiçbirinin tek bir moleküler olaya karşılık gelmediğini, bütün süreçlerin bütün fazlarda işlediğini vurgular. Gecikme boyunca çekirdekler oluşur, uzar ve çoğalır; ThT'nin görebileceği eşiğe ulaşana kadar sinyal düz görünür.

Lif yeni lif doğurur

Çoğalmanın iki yolu var. Parçalanmada bir lif kırılır ve iki yeni uç doğar. İkincil çekirdeklenmede yeni çekirdek, var olan bir lifin uçlarında değil yüzeyinde, çözeltideki moleküllerden kurulur. Cohen ve arkadaşları 2013'te amiloid-β'nın kırk iki kalıntılı biçimiyle (Alzheimer hastalığında biriken plakların bileşeni) bu ayrımı derişim üzerinden ölçtü. Lif kütlesini kendi yarattığı yeni çekirdeklerle artıran bir yol olumlu geri besleme kurar; erken dönemde büyüme üstel olur ve güçlü bir gecikme fazı görünür.

Ekip yarılanma süresini başlangıç derişiminin bir kuvveti olarak yazdı: t½ ∝ m^γ. Ölçülen üs γ = −1,33 ± 0,03'tü; Yang ile Linse'nin 2018 çalışması aynı peptit için −1,3 verir. Derişim ikiye katlanınca süre 2^−1,33 ≈ 0,40 ile çarpılır, yani yaklaşık 2,5 kat kısalır. Ilgın'ın peptidinin üssü bilinmiyor, ama eğrileri aynı ölçeğe oturuyor: 14 × 0,40 ≈ 5,6 saat. Ekip derişime bu kadar güçlü bağlılığın parçalanmayı baskın yol olmaktan çıkardığını yazar; kırılma derişime bağlı değildir.

Tohum çekirdeklenmeyi atlatır. Yoshimura ekibinin deneyinde tohum eklenen çözelti gecikmesiz büyüdü; Subedi ile Tripathi'nin 2022 derlemesi de önceden yapılmış tohumun gecikmeyi kısaltıp kümelenmeyi hızlandırdığını yazar. Üçüncü sıradaki eğrinin düz başı yok, çünkü yüzde birlik kırıntı bekleme fazında kurulması gereken çekirdekleri hazır getirdi.

Zarar nereden geliyor

Bucciantini ve Stefani'nin ekibi 2002'de hastalıkla ilgisi olmayan iki proteinin, bir bakteri proteininin amino ucunun ve bir kinazın küçük bir alanının, kümelenmenin erken evresindeki öbeklerinin hücre için yüksek derecede zehirli olabildiğini gösterdi. Kayed ve Glabe'nin ekibi 2003'te dizileri farklı birçok proteinin çözünür oligomerlerini aynı antikorla tanıdı; bu antikor deney tüpünde zehirliliği de engelledi. Wikipedia lif öncesi ara ürünlerin hücre ölümünden sorumlu tutulduğunu yazar. Cohen ekibine göre ise olgun lif masum bir depo değil: yüzeyi yeni oligomer üretir. Cawood ve Radford'un 2021 derlemesi oligomerlerin az bulunan, kısa ömürlü ve birbirine dönüşen türler olduğunu, bu yüzden yapılarının zor belirlendiğini anlatır.

İşe yarayan lifler

Chapman ve Hultgren'in ekibi 2002'de Escherichia coli'nin curli denen yüzey liflerinin amiloid olduğunu gösterdi. Siemer, curlinin biyofilmin yüzeye ilk tutunmasında belirleyici olduğunu yazar. Chapman ekibine göre bu lifler, çekirdekleyici CsgB'den şaperon benzeri yardımcılara uzanan özel bir düzenekle kurulan verimli bir üretim yoludur. Fowler ve Kelly'nin ekibi 2006'da memeli melanozomunda Pmel17 liflerinin melanin polimerleşmesine kalıp olduğunu, zehirli öncülleri de tutabildiğini buldu. Maji ve arkadaşları 2009'da hipofizin salgı granüllerinde peptit hormonlarının amiloid benzeri çapraz-β hâlde depolandığını bildirdi.

Kendi kalıbını çoğaltan katlanma

NobelPrize.org'un 1997 duyurusuna göre Stanley Prusiner o yıl Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü prionların keşfi için aldı. Prusiner 1982'de tek bir proteinden oluşan bir etkeni prion diye adlandırmıştı. Duyuru, aynı prion proteininin iki ayrı biçime katlanabildiğini, daha kararlı olan ikinci biçimin olağanı kendine çevirerek bir zincir tepkimesi başlattığını anlatır. Wikipedia'nın prion maddesi dönüşümü α-sarmaldan β-tabakaya bir kayma olarak tarif eder; liflerin uçlarından büyüdüğünü, kırıldıkça yeni uçlar açıldığını ekler. Mayada [PSI+] durumu Sup35 proteininin prion hâlidir; Siemer ve Wikipedia, bu hâlde hücrenin durdurma kodonlarını okuyup geçebildiğini ve özelliğin kız hücrelere sitoplazmayla geçtiğini yazar.

Modelin sınırı

• γ yalnız tek bir peptit ve sakin deney tüpü için ölçüldü; Ilgın'ın peptidine aynı üssü uygulamak bir ödünç almadır.
• ThT her şeyi görmez. Wikipedia'nın Thioflavin maddesi boyanın bazı liflerde sinyal vermediğini, bazı amiloid olmayan yapılarda verdiğini yazar; Arosio ekibi de bu ölçümle tam nicel veri almanın güç olduğunu belirtir.
• Deney tüpünde şaperon, proteazom ve hücre içi kalabalık yok. Şaperon Proteinleri ve Protein Kalite Kontrolü derslerindeki yarış, hücrede bir çekirdeğin kurulmadan dağıtılıp dağıtılmayacağını değiştirir.
• 4.255 molekül hesabı protofilament sayısına ve her katmana bir molekül varsayımına dayanır; lif biçimleri bu sayıyı değiştirir.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• "Beyni plaklardan temizleyen" ya da "amiloidi çözen" diye sunulan takviyelere, besinlere ve diyetlere bu eğriler dayanak olmaz; katlanma bozukluğuna bağlı hastalıkların sırası Protein Katlanma Hastalığı dersinde gelecek.

Plakanın son okuması

Ilgın üç eğriyi defterine geçirip altına "2^−1,33 ≈ 0,40" ve "1 µm ≈ 2.128 katman" yazıyor. Lusiferaz satırının yanında tek not var: "bulanık, ThT yok, tohumla hızlanmaz". Kesit baskısı Seniha Hanım'ın elinde. "Noktanın çoğu cam," diyor, "kenarı kristale dönmeye başlamış. Çarşamba hücreyi başka bir zorlamayla deneyeceğiz; o zaman biriken şey katı bir yığın olmayabilir."

Kendini sına

1. Derişim dört katına çıkarsa, γ = −1,33 ile yarılanma süresi kaç kat kısalır?
2. Lusiferaz kuyucuğu en bulanık olduğu hâlde ThT neden parlamadı ve tohum onu neden hızlandırmadı?
3. 4,8 Å aralıkla ve üç protofilamentle bir mikrometrelik lifte kaç molekül olur?
4. Tohum eklenen kuyucukta gecikme fazı neden kayboldu; bu, hızı hangi adımın sınırladığını gösterir?
5. Cohen ekibinin bulgusuna göre olgun lifi "masum bir depo" saymak neden yanıltıcıdır?

Bir sonraki derse köprü

Stres Granülleri dersi zarsız başka bir toplanmaya bakacak. Strese giren hücre çeviriyi duraklatınca mesajcı RNA'lar ve RNA bağlayan proteinler sitoplazmada nasıl damlalar kurar? Hücresel Bölmelendirme dersindeki faz ayrışması bu damlaları açıklar mı; düzensiz bölgeli proteinlerden oluşan sıvı bir damla zamanla katılaşıp bir kümeye, belki bir amiloid lifine dönüşebilir mi, hücre bu geçişi nasıl engelliyor?