Protein Kalite Kontrolü

Dört kap, dört son

Aynı haftanın cuması, Bursa. Ilgın'ın kültür hücreleri yeşil ışıyan bir haberci proteini üretiyor; zincirdeki küçük bir değişiklik onu ısıya duyarlı kılmış. 37 °C'de ışık sitoplazmaya eşit dağılmış. Ilgın dört kabı 42 °C'de on beş dakika tuttu, ardından 37 °C'ye döndürdü.

Birinci kapta sönen ışık iki saatte yarıya kadar döndü. İkinci kapta hücreler Hsp70'i fazladan yapıyor; ışıklarının çoğu döndü. Üçüncü kaptakiler CHIP adlı proteini fazladan yapıyor; ışık hiç dönmedi, jelde haberci bandı hızla soldu. Aynı kaba proteazomu durduran kimyasal eklenince bant yerinde kaldı. Dördüncü kapta yalnız proteazom durduruldu. Mikroskopta çoğu hücrede çekirdeğin yanında tek, iri, parlak bir nokta duruyor. Bazı hücrelerde iki nokta seçiliyor: biri çekirdeğe yaslanmış, öteki daha küçük ve kenarda.

Ilgın bir de kovalama (chase) kurmuş: yeni çeviriyi durduran bir kimyasal ekleyip otuz dakikada bir örnek almış. Olağan kapta kalan haberci 100, 70, 49, 35; CHIP'i fazla kapta 100, 35, 12, 4; proteazomu durmuş kapta 100, 98, 96, 95. "Aynı protein, aynı ısı," diyor Ilgın. "Kararı kim veriyor?" Seniha Hanım omuz silkiyor: "Belki kimse."

Mekanizma

Bir seçim değil, bir yarış

Wickner, Maurizi ve Gottesman'ın 1999 derlemesi işe ortak bir tanıma noktasından başlar: şaperonlar da enerji harcayan proteazlar da yüzeye çıkmış yağ seven bölgeleri tanır. Derlemenin özetine göre proteinin katlanmadan yıkılıp yıkılmayacağını, şaperonlarla proteazlar arasındaki paylaşımın kinetiği belirler; iki yol da başaramazsa hasarlı proteinler küme olarak birikir. Ekip iki yıl önce bir makale başlığında buna triyaj demişti. Lindquist ile Kelly'nin 2011 derlemesi aynı tabloyu "sürekli bir kinetik yarış" diye anlatır: katlanma tek bir zincirin içinde olur, kümelenme ise derişime bağlıdır. Boşa giden katlanma denemeleri, onlara göre, yükü sonunda yıkıma yönlendirir. Wikipedia'nın agresom maddesi de üç yolu sayar: yeniden katlama, yıkım ve kümeleri çekirdeğin yanında toplama.

Protein Katlanması dersinde kümelenmeyi tek zincirin kendi içindeki düzenlenmeden ayırmıştık: orada ayrı zincirler açık yüzlerinden birbirine tutunuyordu. Yarışın üçüncü kolu o tutunmadır.

Payları hızlar böler

Açılmış zincire U diyelim ve her yolu birinci dereceden bir hız sabitiyle anlatalım: katlanma k_f, yıkıma işaretlenme k_d, kümelenme k_a. Bir zincirin bir yola düşme olasılığı o yolun sabitinin toplama oranıdır: pay = k_i ÷ (k_f + k_d + k_a). Zincirin açık kaldığı ortalama süre de 1 ÷ toplamdır. Kurgu değerler dakika başına:

İkinci satırda 1,8 ÷ 2,2 ≈ 0,82 eder. İşaretlenme sabiti değişmediği hâlde payı 0,30'dan 0,3 ÷ 2,2 ≈ 0,14'e iner; kümelenme de 0,1 ÷ 2,2 ≈ 0,05'e düşer. Hızlanan yol öbürlerinin zamanını çalar. Üçüncü satırda 0,9 ÷ 1,6 ≈ 0,56 ile işaretlenme öne geçer ve katlanma 0,6 ÷ 1,6 = 0,375'e geriler.

Proteazom durunca yarışın kendisi değişmez; değişen, işaretlenen zincirin akıbetidir. Payların 0,30'u etiketlenir ama yıkılmaz ve 0,10'luk kümeye katılır: katlanmamış kalan 0,30 + 0,10 = 0,40'a çıkar. Dördüncü kaptaki parlak nokta bu birikimin yeridir.

Kovalamada olağan kapta haberci 60 dakikada 100'den 49'a, yani yaklaşık yarıya iniyor: t½ ≈ 60 dakika, k = ln 2 ÷ t½ = 0,693 ÷ 60 ≈ 0,012 dakika başına. CHIP'i fazla kapta 30 dakikada 35'e düşüyor; dört noktaya çizilen doğru t½ ≈ 19 dakika verir. Proteazomu durmuş kapta doksan dakikalık kayıp yüzde beştir.

Şaperonun içindeki E3

Ballinger ve arkadaşları 1999'da Hsc70'in karboksil ucuna bağlanan, 35 kilodaltonluk yeni bir protein buldu ve ona CHIP adını verdi. Protein, tetratrikopeptit tekrarı (TPR) denen bir bağlanma bölgesi taşıyordu. Arıtılmış sistemde Hsp40'ın uyardığı ATP yıkımını baskıladı, Hsp40 ile Hsp70'in lusiferazı yeniden katlamasını da engelledi. Pratt ekibinin 2015 derlemesi de bu kütleyi verir ve TPR bölgesinin Hsp90'a da bağlandığını yazar.

Murata ile Tanaka'nın ekibi 2001'de CHIP'in karboksil ucundaki U-box bölgesinin onu bir E3 ubikitin ligazı yaptığını gösterdi. Isıyla bozulmuş ateşböceği lusiferazı ancak Hsp90 ya da Hsc70 ile Hsp40 tarafından yakalanmışken çoklu ubikitin aldı; U-box'ı olmayan CHIP etkisizdi. Connell ve arkadaşları aynı yıl CHIP'in Hsp90'a bağlanıp glukokortikoid reseptörünü ubikitinlediğini ve proteazoma gönderdiğini bildirdi; makalenin başlığı, CHIP'in "triyaj kararlarını" düzenlediğini söyler.

Tabloda CHIP yalnız k_d'yi büyütüyordu; Ballinger'in bulgusuna göre aynı protein Hsp70 döngüsünü yavaşlattığı için k_f'yi de küçültür. Pratt ekibi zamanın rolünü Hsp90 için tarif eder: şaperon yükle döngüye girebildiği sürece CHIP'in ubikitinlemesi baskılanır; zincir döngüye artık giremeyecek kadar açıldığında ubikitinleme karşısız kalır. Çarşamba Seniha Hanım'ın sorduğu "Hsp70 ne zaman bırakır?" sorusunun cevabı tek bir an değil, bu tekrarların sayısıdır.

Hangi kapıya teslim

Lüders, Demand ve Höhfeld 2000'de BAG-1'in amino ucunda ubikitine benzeyen bir bölge bulunduğunu ve proteinin 26S proteazoma bağlandığını gösterdi. Demand ve arkadaşları 2001'de BAG-1'in CHIP'le doğrudan etkileştiğini, yükü şaperondan alıp CHIP'in ubikitin düzeneğine sunduğunu yazdı.

Gamerdinger ile Behl'in ekibi 2009'da iki aile üyesini karşılaştırdı: BAG1 ubikitinli proteinleri proteazoma, BAG3 makrootofajiye yönlendiriyordu. Yaşlanma modellerinde hücreler BAG1'den BAG3'e kaydı; kemirgen beyninde de yaşla BAG3'ün BAG1'e oranı arttı. Behl'in 2016 derlemesi BAG3 aracılı seçici makrootofajiyi stres ve yaşlanma sırasında kurulan bir uyum olarak anlatır. Makrootofaji dersinde ubikitinli kümeleri LC3-II'ye bağlayan p62'yi görmüştük; Gamerdinger ekibine göre BAG3 bu yolu p62 ile birlikte işletir.

Ribozomda takılan zincir

Triyaj zincir ribozomdan çıkmadan da kurulur. Brandman ile Hegde'nin 2016 derlemesine göre çeviri bozuk bir mesajcı RNA, yüklü tRNA kıtlığı ya da genetik bir hata yüzünden yarıda kalabilir. Bengtson ile Joazeiro 2010'da mayada ribozoma bağlı duran, RING türü bir E3 olan Ltn1'in, durdurma kodonu olmayan mesajdan çıkan zinciri ubikitinleyip proteazoma gönderdiğini gösterdi. Brandman'ın grubu 2012'de kompleksin bütününe ribozom kalite kontrol kompleksi adını verdi ve onun takılı zinciri taşıyan büyük alt birime oturduğunu buldu.

Shen ile ekibinin 2015 çalışması ile Eisenack ve Trentini'nin 2023 derlemesi sırayı aynı biçimde kurar: takılan ribozomun küçük alt birimi ayrılır, zincir büyük alt birimde tRNA'ya bağlı kalır. Memelide Listerin ile NEMF, mayada Ltn1 ile Rqc2 bu büyük alt birime gelir. Shen ekibine göre Rqc2 mayada zincirin ucuna mesajcı RNA olmadan alanin ve treonin ekler: CAT kuyruğu. Eisenack ile Trentini bu kuyruğun Listerin'in ubikitinlemesine yardım edebildiğini ya da serbest kalan zincirde yıkım işareti olarak iş görebildiğini yazar.

Yeni zincirin ne kadarı hemen gider

Schubert'in ekibi 2000'de kusurlu ribozom ürünlerinin (defective ribosomal products, DRiP) yeni yapılan proteinlerin yüzde 30'unu aşabildiğini bildirdi. Eisenack ile Trentini bu tahmini aktarır, bazı koşullarda oranın üçte ikiye çıktığını da ekler. Yöntem, işaretli amino asidin yeni zincirlere girişini proteazomu engellenmiş ve engellenmemiş hücrelerde karşılaştırıyordu; derlemeye göre engelleyici işaretlemenin verimini de değiştirebilir. Vabulas ile Hartl 2005'te yeni zincirlerin büyük ölçüde yıkımdan korunduğunu buldu; Eisenack ile Trentini onların tahminini çeviriden hemen sonra birkaç yüzde, 30–60 dakikada yüzde 20 dolayı olarak verir.

Kurtarılamayanın adresi

Johnston, Ward ve Kopito 1998'de proteazomu engelledikleri hücrelerde deterjanda çözünmeyen, çoklu ubikitinli CFTR biçimlerinin biriktiğini ve sentriyollerin çevresinde tek bir yapıda toplandığını gördü. Bu yapıya agresom dediler. Vimentin çevresinde bir kafes kuruyordu; mikrotübüller bozulunca agresom oluşmadı. Wikipedia'nın agresom maddesi taşımanın mikrotübül boyunca, dinein motoruyla yapıldığını yazar. Gamerdinger ekibi 2011'de BAG3'ün dineine tutunup Hsp70'in yüklerini ubikitinden bağımsız biçimde agresoma taşıdığını gösterdi. Moleküler Motorlar dersinde eksi uca yürüyen dineini, Mikrotübüller dersinde eksi uçların sentrozomda toplandığını görmüştük: yük merkeze gelir.

Kaganovich, Kopito ve Frydman 2008'de maya ve memeli hücrelerinde iki ayrı bölme tanımladı. Çözünür, ubikitinli yanlış katlanmış proteinler çekirdeğin kıyısında, proteazomların yoğunlaştığı bölmede (JUNQ) toplanıyordu; son aşamaya varmış kümeler ise mayada vakuolün yanındaki bölmeye (IPOD) gidiyordu. Bir prion proteininin ubikitinlenmesi artırılınca çekirdek yanına kaydı. Wikipedia'nın JUNQ ve IPOD maddesine göre birincideki proteinler sitozolle yer değiştirir, ikincidekiler sıkı paketlenmiştir. Dördüncü kaptaki iki nokta bu ayrımın kurgudaki karşılığıdır.

Ayırma bölünmede de sürer. Aguilaniu ile Nyström 2003'te tomurcuklanan mayada oksitlenmiş proteinlerin kız hücreye geçmediğini, Sir2 geni silinince ana hücrenin onları tutamadığını gördü. Aynı gruptan Liu 2010'da kız hücreye geçen kümelerin bir miyozin motoruyla ana hücreye geri akabildiğini buldu.

Modelin sınırı

• Kümelenme derişime bağlıdır; Lindquist ile Kelly onun yüksek dereceden işlediğini yazar. k_a'yı sabit almak sadeleştirmedir: açılmış zincir iki katına çıkınca ikinci dereceden bir yapışma k_a'yı 0,2'ye çıkarır ve paylar 0,55, 0,27, 0,18 olur.
• Yollar birbirinden bağımsız değildir: CHIP hem k_d'yi büyütür hem k_f'yi küçültür; Hsp70 aynı yükü hem katlamaya hem CHIP'e sunar.
• Zincir tek bir açık hâlde beklemez; şaperona defalarca bağlanıp ayrılır. Tek basamaklı yarış bu döngüleri ortalar.
• Bölmelerin çoğu aşırı yapılan haberci proteinlerle ve mayada tanımlandı; olağan miktardaki bir yükün aynı yolu izlediği her hücrede gösterilmedi.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Takviye, oruç, sauna ya da soğuk uygulamalarının hücre içi temizliği veya "protein kalitesini" artırdığı iddiası için bu yarıştan bir sonuç çıkmaz.

Dördüncü kaptaki nokta

Ilgın tabloyu defterine geçirip altına "0,693 ÷ 60 ≈ 0,012" ve "CHIP: t½ ≈ 19 dk" yazıyor; kenardaki iki küçük dairenin yanına "çözünür, ubikitinli" ve "sıkı, değişmiyor" notlarını düşüyor. Seniha Hanım dördüncü kabı mikroskoptan çekiyor. "Kimse karar vermedi," diyor. "Hızlar verdi. Ama bu nokta büyürse içinde ne olur, bir düzen kurulur mu? Pazartesi o noktanın içi konuşulacak."

Kendini sına

1. Olağan koşulda k_a'yı 0,1'den 0,3'e çıkarın. Üç payı yeniden hesaplayın; hangi yol en çok kaybeder?
2. Hsp70 artınca k_d sabit kaldığı hâlde işaretlenen pay neden azalır?
3. Proteazom durduğunda yarışın payları değişmediği hâlde katlanmamış kalan zincir neden artar?
4. Bir kovalamada kalan protein 40 dakikada yarıya iniyor. Hız sabitini bulun ve CHIP'i fazla kapla karşılaştırın.
5. Ubikitinlenmesi artırılan prion proteininin bölme değiştirmesi, ayırmanın rastgele olup olmadığı konusunda neyi düşündürür?

Bir sonraki derse köprü

Agregasyon ve Amiloid dersi, bu noktanın içine bakacak. Düzensiz (amorf) bir yığın ile çapraz-β dizilmiş düzenli bir amiloid lifi nasıl ayırt edilir? Lif oluşumu neden bir gecikme fazıyla başlar ve bu fazda çekirdeklenme (nükleasyon) ne iş görür? Hazır bir lif başka zincirleri tohumlayabilir mi; zarar daha çok küçük oligomerlerden mi, olgun liflerden mi kaynaklanır?