Ubiquitin–Proteazom Sistemi

Şeridin tepesindeki leke

Çarşamba, şubatın ilk haftası, Bursa. Pazartesinin bulanık tüpü hâlâ tezgâhın ucunda duruyor. Ilgın bu kez arıtılmış enzimle değil, lusiferazı kendi içinde yapan kültür hücreleriyle çalıştı. İki kabı 42 °C'lik inkübatörde on dakika ısıttı, sonra olağan sıcaklığa aldı. İkinci kaba proteazomu durduran bir kimyasal ekledi. Dört saat sonra iki kabı da topladı, proteinlerini jelde boyuna yürüttü ve zara aktarıp lusiferaz antikoruyla boyadı.

Birinci şeritte 61 kilodaltonluk bant soluk. İkinci şeritte bant koyu, üstünde de eşit aralıklı birkaç ince bant var; daha yukarıda bantlar birbirine karışıp jelin tepesine kadar uzanan bir lekeye dönüşüyor. Aynı zarı ubikitin antikoruyla boyadığında leke yerinde kalıyor. Işık ölçerin sayısı ise iki kapta da düşük. "Yıkımı durdurdum," diyor Ilgın, "ama hiçbirini kurtarmadım."

Seniha Hanım dondurucudan tavşan retikülositlerinden hazırlanmış bir özüt çıkarmış. İki tüpe işaretli, bozulmuş bir protein koyuyor. Birine ATP ekliyor, ötekinin ATP'sini bir enzimle tüketiyor. İki saat sonra ATP'li tüpte işaretin yüzde 62'si küçük parçalara geçmiş, ATP'siz tüpte yüzde 9'u. Ilgın şaşırıyor: "Bir şeyi parçalamak neden enerji istesin?"

Mekanizma

Enerji isteyen yıkım

Ilgın'ın sorusu eski bir bulmacadır. NobelPrize.org'un 2004 Kimya Ödülü için hazırladığı metne göre bağırsaktaki tripsin ya da lizozomdaki enzimler proteini enerji harcamadan parçalar. Oysa Simpson 1953'te karaciğer dilimlerinde hücrenin kendi proteinlerinin yıkımının enerji istediğini bulmuştu. Etlinger ile Goldberg 1977'de retikülositlerden hücresiz bir özüt hazırladı; özüt anormal proteinleri ancak ATP varken yıkıyordu. Nobel komitesinin ayrıntılı metni, bu etkinliğin pH 7,8 dolayında en yüksek olduğunu ve asit seven lizozom enzimlerini bu yüzden dışarıda bıraktığını yazar. Wikipedia'nın proteazom maddesi de olgun olmayan alyuvar öncülünün lizozomdan yoksun olduğunu ekler.

Aaron Ciechanover ile Avram Hershko 1978'de hemoglobini ayırmak için özütü bir kolondan geçirdi ve iki kesir elde etti. İkisi de tek başına etkisizdi; birleşince yıkım geri geldi. Birinci kesirdeki etken, ısıya dayanıklı ve dokuz bin dolayında kütleli küçük bir proteindi. Irwin Rose'un laboratuvarındaki ortak çalışmayla 1980'de bu proteinin yıkılacak proteinlere kovalent bağlandığı ve aynı yüke çok sayıda kopyasının takılabildiği gösterildi. Ardından onun ubikitin olduğu anlaşıldı. NobelPrize.org ile Wikipedia'nın ubikitin maddesine göre üçlü, 2004 Kimya Nobeli'ni "ubikitin aracılı protein yıkımını keşfettikleri" için paylaştı.

Etiketin kendisi

Nobel metni de Wikipedia da ubikitini 76 amino asitlik bir protein olarak verir. UniProt'taki insan kaydında da 76 kalıntılık zincir, daha uzun bir öncülden kesilir. Nobel komitesi, ilk araştırmacıların ubikitinin dizisinin çok korunmuş olduğunu ve bu yüzden yolun genel bir önemi olabileceğini düşündüğünü aktarır. Wikipedia insan ve maya ubikitininin yüzde 96 özdeş olduğunu yazar.

UniProt dizisinden kalıntıların ortalama kütleleri toplanınca yaklaşık 8.565 dalton çıkar; Wikipedia 8,6 kilodalton der. Kalıntı başına kaba 110 daltonla 76 × 110 = 8.360 eder, yani kestirme yüzde 2,4 kadar şaşar.

Üç kademe

Pazartesi Hsp70'in döngüsünü ATP'nin sürdüğünü görmüştük; burada ATP etiketi yüklemek için harcanır. Wikipedia'ya göre E1 adlı etkinleştirici enzim ATP'yi kullanarak ubikitinin ucunu etkinleştirir ve kendi sisteinine bağlar. Ubikitin oradan E2 denen taşıyıcı enzime geçer. E3 ligaz hem yükü hem yüklü E2'yi tanır ve ubikitini hedefe aktarır. Stewart ve arkadaşlarının 2016 derlemesi E3'leri RING, HECT ve ikisinin melezi olan RBR türlerine ayırır: RING türü ubikitini E2'den doğrudan yüke verir, HECT türü önce kendi üstüne alır. Mitofaji dersinde Parkin'i bu ailenin bir üyesi olarak görmüştük.

Sayılar bir dağıtım ağacı çizer. Tanaka'nın 2009 derlemesi insanda iki E1, yaklaşık otuz E2 ve beş yüzü aşkın E3 sayar; Kliza ile Husnjak'ın 2020 derlemesi iki E1, otuza yakın E2 ve altı yüzü aşkın E3 bildirir. Wikipedia E2 için otuz beş, Stewart ekibi ubikitin benzeri küçük proteinleri de katarak kırk dolayında der. Yuvarlak sayılarla her E1'e 30 ÷ 2 = 15 E2, her E2'ye ortalama 600 ÷ 30 = 20 E3 düşer. Seçicilik ağacın ucundadır: Tanaka'ya göre her E3 genellikle belirli bir yükü tanır.

Zincirin dili

Ubikitinin kendisi de yedi lizin taşır ve sonraki ubikitin bunlardan birine bağlanabilir. Wikipedia ile UniProt kaydı, 48. sıradaki lizinden kurulan zincirin proteini proteazoma gönderdiğini yazar. Aynı iki kaynağa göre 63. lizinden kurulan zincir endositoz, DNA onarımı ve sinyal yollarında iş görür. Gierisch, Barchi ve Dantuma'nın 2026 derlemesi de çoğu bağ türünün yıkıma yol açabildiğini, yalnız 63. lizin zincirinin bunun dışında kaldığını belirtir.

Zincirin uzunluğu da bir eşik taşır. Thrower ve arkadaşları 2000'de yapısı bilinen model yüklerle dörtlü ubikitin zincirinin proteazoma verimli yönlendirmenin en küçük işareti olduğunu gösterdi. Mekanizma, zincirin kendi başına proteazoma tutunup yükün yakınlığını artırmasıydı. Wikipedia en az dört ubikitinlik zincir gerektiğini aynı biçimde yazar. Thrower ekibi tek ubikitinin, örneğin endositozda, ayrı bir sinyal olarak okunabildiğini de not eder. Yüzeyden alınan alıcıyı ubikitinle ESCRT'ye teslim eden yol, Endozomal Sistem dersinde bu ayrı dilin örneğiydi.

Dörtlü zincir küçük değildir. Dört ubikitin, bağlanırken çıkan üç su molekülü düşülünce yaklaşık 34,2 kilodalton eder; 300 kalıntılık bir protein 300 × 110 = 33.000 daltondur. İşaret, taşıdığı yük kadar ağır olabilir.

Etiket geri de alınır. Kliza ve Husnjak yüzü aşkın, Wikipedia yaklaşık yüz deubikitinaz geni sayar; Tanaka bu sayıyı doksan beş dolayında verir. Bu enzimler zinciri kırpar, söker ya da yükün kaderini erteler.

Fıçının ağzı

Pazartesi GroEL'in odasında zinciri doğal biçimine kavuşturan bir kafes görmüştük. Proteazom da fıçıya benzer, ama işi tersidir. Tanaka ile Pei ve arkadaşlarının 2026 tarihli derlemesi 20S çekirdeği yedişer alt birimli dört halkadan kurulu anlatır: dışta iki α, içte iki β halkası, α7β7β7α7. Tanaka'ya göre β1, β2 ve β5 alt birimleri sırasıyla kaspaz benzeri, tripsin benzeri ve kimotripsin benzeri etkinlik taşır; bağları asidik, bazik ve yağ seven kalıntılardan sonra keser.

Tanaka ile Pei ekibine göre 19S kapağın tabanında altı AAA ATPaz bir halka kurar; ubikitin alıcıları zinciri yakalar, kapaktaki bir deubikitinaz zinciri keser ve ubikitini yeniden kullanıma bırakır. Peroksizom Yapısı dersinde PEX5'i zardan çeken PEX1 ile PEX6 de bu ailedendi. ATPaz halkası yükü ATP harcayarak açar ve kanaldan çekirdeğe iter. Ilgın'ın ATP'siz tüpü bu adımda takılır.

Pazartesinin cevabı hesapla gelir. Altmış kilodaltonluk katlanmış bir proteinin yarıçapını 2,58 nanometre bulmuştuk; çapı 52 ångström eder. Wikipedia çekirdeğin girişinin 13 ångströme kadar daralabildiğini, Pei ekibi ATPaz kanalının yaklaşık 10 ångström olduğunu ve kapının açılınca 22 ångströme genişlediğini yazar. 52 ÷ 13 = 4, 52 ÷ 22 ≈ 2,4: lusiferaz katlı hâliyle kapıdan geçemez. Zincir açılmak zorundadır. Thrower ekibinin bulguları da katlı proteinlerin yıkımında hızı belirleyen adımın açılma olduğunu düşündürür.

Kisselev ekibinin 1999 ölçümünde tavşan kasından arıtılan proteazomlar 3 ile 22 kalıntı arası peptitler üretti; Tanaka 3 ile 15 arası der, Nobel metni ve Wikipedia tipik ürünü sekiz dolayında verir. Ortalama sekiz kalıntıyla 550 kalıntılık lusiferaz 550 ÷ 8 ≈ 69 peptide bölünür.

Uçtaki harf

Yükü E3 nasıl seçer? Bachmair, Finley ve Varshavsky 1986'da mayada ubikitinle kaynaştırılmış bir enzimin ucunu değiştirdi; ubikitin kesilince açığa çıkan tek bir amino asit, aynı proteinin ömrünü yirmi saatin üstünden üç dakikanın altına kadar değiştirdi. Wikipedia'nın N-son kuralı maddesi ile Varshavsky'nin 2011 derlemesi bunu ilk yıkım işaretlerinden biri, N-degron olarak anlatır.

Kalneksin döngüsünden düşüp ER'den sitozole geri çekilen zincirin yolu da, Protein Katlanması dersinde gördüğümüz gibi, bu makinede bitmişti. Peroksizomal Hastalıklar dersindeki G843D değişikliğini taşıyan PEX1 de iş görebildiği hâlde proteazomda yıkılıyordu.

Proteazomu durduran ilaçlar bazı kan kanserlerinin tedavisinde kullanılır; hangi ilacın kime verileceği burada tartışılmıyor.

Modelin sınırı

• Dört ubikitin eşiği tanımlı model yüklerde ve arıtılmış proteazomla ölçüldü; Gierisch ekibine göre hücrede dallı zincirler de başlıca yıkım işaretleri arasındadır.
• Tanaka'ya göre oksitlenmiş ya da doğal hâlde yapısız proteinler ubikitinsiz, doğrudan 20S çekirdekte yıkılabilir.
• Retikülosit özütü olgunlaşmakta olan, lizozomsuz bir alyuvar öncülünden gelir; başka dokularda yıkım yollarının payı farklıdır.
• Kurgu jeldeki leke zincirin hangi lizinden kurulduğunu göstermez; bunu bağa özgü antikorlar ya da kütle spektrometrisi ayırır.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• "Proteazomu çalıştıran" ya da "hücre çöpünü temizleyen" diye sunulan takviye ve uygulamalar için bu mekanizmadan bir sonuç çıkmaz; Gierisch ekibi, klinikte kullanılabilir proteazom etkinleştiricileri geliştirme çabasının engelleyicilere göre çok daha yavaş ilerlediğini yazar.

İki tüp, bir şerit

Ilgın defterine "ATP'li: %62, ATP'siz: %9" yazıyor. Altına "52 Å ÷ 13 Å = 4", "2 → 30 → 600" ve "550 ÷ 8 ≈ 69" notlarını ekliyor. Seniha Hanım ikinci şeridi ışığa tutuyor. "Bu kaptaki zincirler işaretlendi, ama ne kurtarıldı ne yıkıldı," diyor. "Hsp70 bir zinciri ne kadar süre tutar, ne zaman bırakır? Cuma o kararı kimin verdiğine bakacağız."

Kendini sına

1. Retikülosit özütünün pH 7,8 dolayında en etkin olması, yıkımın lizozomdan gelmediğini neden düşündürür?
2. Üç ubikitinlik bir zincirin kütlesini hesaplayın. Thrower ekibinin bulgusuna göre bu zincir proteazoma verimli yönlendirme için yeterli midir?
3. Bir hücrede 63. lizin zincirleri artarsa proteazomun yükü artar mı? Gerekçeyi zincirin diliyle yazın.
4. 40 kilodaltonluk katlı bir proteinin çapını Erickson formülüyle bulun ve 22 ångströmlük açık kapıyla karşılaştırın.
5. Ilgın'ın ikinci kabında ışık neden geri gelmedi? Yıkımı durdurmakla katlamayı geri kazanmak arasındaki farkı açıklayın.

Bir sonraki derse köprü

Şaperonun tuttuğu zincirle proteazomun açtığı zincir arasındaki kavşağa Protein Kalite Kontrolü dersinde bakacağız. Açılmış bir zincir karşısında hücre "yeniden katla" ile "yık" arasında nasıl seçim yapar? Hsp70'e bağlanıp taşıdığı yükü ubikitinleyen CHIP adlı E3, şaperonu yıkıma bağlayan bir köprü sayılabilir mi; bu triyaj, ribozomda takılıp kalan zincirler için de kurulmuş mudur?