Şaperon Proteinleri

Sönen ışık

Şubatın ilk haftası, pazartesi sabahı, Bursa. Pencereden görünen dağın tepesi beyaz; bir üniversitenin protein biyokimyası laboratuvarında ısı bloğu geceden beri yanıyor. Seniha Hanım yıllardır arıtılmış proteinlerin nasıl açılıp yeniden katlandığını ölçüyor. Ilgın bu dönem doktoraya başladı ve ilk deneyini ateşböceğinin ışık enzimi lusiferazla kurdu.

Lusiferaz çözeltisi on dakika 42 °C'de bekletilmiş. Işık ölçer, ısıtmadan önceki değerin ancak yüzde beşini okuyor; tüpün dibinde ince bir bulanıklık var. Ilgın ısıtılmış çözeltiyi 30 °C'deki beş tüpe paylaştırmış. Yalnız tampon olan tüp bir saat sonra da karanlık. Hsp70, bir Hsp40 ve bir nükleotit değiştirici faktör ile ATP eklenen tüp ışığının üçte ikisini geri kazanmış. Aynı üç protein ATP'siz verilince ışık yüzde beşte kalmış. Hsp40 eksik tüpte artış zar zor seçiliyor. Beşinci tüpte bakterinin fıçı biçimli GroEL–GroES ikilisi ve ATP var; ışık yine pek dönmemiş.

Arka odadan bir jel de gelmiş: kültür hücreleri 42 °C'de yarım saat tutulmuş, sonra olağan sıcaklığa alınıp saat saat toplanmış. Hsc70 bandı bütün saatlerde aynı kalınlıkta. Hsp70 bandı ise ikinci saatte belirmiş, sekizinci saatte koyulaşmış.

"Isı lusiferazı bozdu," diyor Ilgın, "ama bir tüpü de hücreyi de düzeltiyor."

Bu sabahın soruları

Önce zincirin ribozomdan çıktığı anda kimle karşılaştığına, sonra sitozolde katlanmaya yardım eden ailelere bakacağız. Beşinci tüpün neden karanlık kaldığını bir hacim hesabıyla tartacağız. Ardından hücrenin bu proteinleri ısıda neden çoğalttığına geleceğiz.

Metin

Ribozomun ağzında

Protein Katlanması dersinde biçimin dizide yazılı olduğunu, Anfinsen'in ribonükleazının yardımsız eski hâline döndüğünü görmüştük. Moleküler şaperonu da orada tanımlamıştık: açıkta kalan yağ seven yüzleri bir süre örten, ama son biçime katılmayan protein. Lasker Vakfı'nın 2011 ödül metni sorunun hücredeki yüzünü hatırlatır: hücre içindeki protein derişimi Anfinsen'in tüpündekinden çok daha yüksektir ve derişim arttıkça kümelenme olasılığı da artar.

Sitozolde ilk eller ribozomun çıkış ağzında bekler. Deuerling, Gamerdinger ve Kreft'in 2019 derlemesi bunları bakterideki tetik faktör (trigger factor), arkelerle ökaryotlardaki yeni zincirle ilişkili kompleks (nascent polypeptide-associated complex, NAC) ve ökaryotlardaki ribozomla ilişkili kompleks (ribosome-associated complex, RAC) diye sayar. Ott ve arkadaşlarının 2015 çalışması NAC'ı ribozomdan çıkan zincirle ilk etkileşen etken olarak tanımlar ve arkelerden insana korunduğunu yazar. Mayadaki RAC'ın bir Hsp40 ile bir Hsp70 akrabasından kurulduğunu da ekler.

Bu ilk eller birbirinin yedeğidir. Teter ve arkadaşları 1999'da tetik faktörü silinmiş bakteride yeni zincirlerin Hsp70'e giden payının iki katına çıktığını gördü. İki şaperon birlikte silinince bakteri olağan koşulda yaşayamadı.

Hsp70'in iki ortağı

Protein Katlanması dersinde ER'deki BiP'in ATP'yle açılıp ADP'yle kapanan kapağını izlemiştik. Şaperon Aracılı Otofaji dersinde de aynı ailenin sitozoldeki üyesi Hsc70'i yükü lizozoma götürürken görmüştük. Kapak döngüsü sitozolde de aynıdır; yeni olan, döngünün hızını iki ortak proteinin belirlemesidir.

Saibil'in 2013 derlemesine göre Hsp40'ın J alanı Hsp70'in ATPazını etkinleştirir; nükleotit değiştirici faktörler ATP yıkımından sonra ADP'nin çıkmasını hızlandırır. Malkeyeva ve arkadaşlarının 2025 derlemesi döngüyü aynı sırayla çizer: Hsp40 yükü getirir ve ATP yıkımını uyarır, cep yükün üstüne kapanır, değiştirici faktör ADP'yi ATP ile değiştirir, cep açılır ve zincir bırakılır.

Ilgın'ın tüpleri bu düzenin bakteri sürümüne dayanır. Szabo ve arkadaşları 1994'te bozulmuş lusiferazın önce DnaJ'ye tutunduğunu, DnaK'nin ATP'sini yıkıp yükü sıkıca kavradığını, GrpE'nin ADP'yi çıkardığını ve yeni ATP'nin yükü serbest bıraktığını gösterdi. Tek tur lusiferazın yalnız bir kesrini katlıyordu; tam verim için birkaç tur gerekiyordu. Schröder ve arkadaşları 1993'te bakterinin içinde 42 °C'de hızla sönen lusiferazın 30 °C'de yeniden ışıdığını, bunun için üç proteinin de gerektiğini buldu. Tüpte geri kazanım üçü ile ATP'yi istiyordu; GroEL–GroES istemiyordu.

Freeman ile Morimoto'nun bulgusu kurgudaki ısıtma basamağını da açıklar. Şaperon zinciri ısının en yüksek anında katlamaz, tutar. Asıl katlanma sıcaklık düşünce gelir.

Fıçının içinde

Bazı zincirler Hsp70'in tutup bırakmasıyla yola çıkamaz. Saibil'e göre bunlar için şaperoninler vardır. Bakterinin GroEL'i, yedişer altmış kilodaltonluk alt birimden kurulmuş, sırt sırta iki halkadan oluşan on beş nanometrelik bir silindirdir. ATP bağlayan halkanın ağzına yedi küçük alt birimli GroES kapak gibi oturur ve içi su seven bir odaya dönüşür. Xu, Horwich ve Sigler'in 1997 kristal yapısına göre kapak oturunca boşluğun hacmi ikiye katlanır, yükü tutan yağ seven kalıntılar kapağın altına gömülür.

Wikipedia'nın TRiC maddesi insan kompleksini sekizer benzer ama özdeş olmayan alt birimden oluşan iki halka olarak tarif eder. Hem bu madde hem Malkeyeva ekibi aktin ile tubulini onun en bilinen yükleri arasında sayar.

Ellis'in 1990'lardaki yazıları bu odayı Anfinsen kafesi (Anfinsen cage) diye anar; Csermely de 1999'da bu şaperonları aynı adla gruplar. Ad işi özetler: zincir, Anfinsen'in seyreltik tüpündeki gibi komşusuz kalır. Hayer-Hartl, Bracher ve Hartl'ın 2016 derlemesi kapağın yükü kümelenmenin bozamayacağı genişlemiş bir odaya ittiğini yazar; kafesin katlanmayı ayrıca hızlandırıp hızlandırmadığı ise hâlâ tartışılmaktadır.

Bu düzeni Arthur Horwich ile Franz-Ulrich Hartl'ın ortak çalışmaları açtı. Lasker Vakfı'na ve Wikipedia'daki maddelerine göre ikili bu buluşlar için 2011'de temel tıp araştırmaları dalındaki Albert Lasker ödülünü aldı. Lasker metni başlangıcı Horwich'in bir maya mutantına bağlar: mitokondriye alınan bir enzim orada etkinlik kazanamıyordu. Bozuk gen Hsp60'tı.

Kafese ne sığar

Saibil kapalı odanın ancak altmış kilodaltondan küçük alt birimleri alabildiğini yazar; Malkeyeva ekibi de en büyük yükün boşluğun hacmiyle sınırlandığını, GroEL'de bu hacmin yaklaşık 175.000 ångström küp olduğunu belirtir. Korobko ve arkadaşlarının 2020 çalışması aynı hacmi kullanır. Bin ångström küp bir nanometre küp olduğundan oda 175 nm³ eder; aynı hacimde bir küre düşünülürse yarıçapı yaklaşık 3,47 nanometredir.

Nükleer Por Kompleksi dersinde Erickson'ın R = 0,066 × M^(1/3) formülünü, küre sayılan bir proteinin alabileceği en dar yarıçap için kullanmıştık. Altmış kilodalton için 60.000^(1/3) ≈ 39,1, R ≈ 0,066 × 39,1 ≈ 2,58 nm çıkar. Hacmi 4/3 × π × 2,58³ ≈ 72 nm³'tür; Korobko ekibinin dalton başına 1,23 ångström küp varsayımı 74 nm³ verir. Katlanmış protein odanın 72 ÷ 175 ≈ 0,41'ini doldurur ve çeperle arasında 3,47 − 2,58 ≈ 0,9 nanometre kalır. Katlanmaya çalışan zincir doğal biçiminden daha gevşek ve daha hacimlidir; ona kalan pay bir nanometreden azdır.

UniProt kaydına göre ateşböceği lusiferazı 550 amino asitlik, yaklaşık 61 kilodaltonluk bir zincirdir; ortalama 110 daltonlu kalıntılarla 550 × 110 ≈ 60.500 aynı sonucu verir. Peroksizom Yapısı dersinde ucundaki üç harfle peroksizoma giden enzim buydu. Sınırın hemen üstündedir. Beşinci tüpteki karanlık bu hesapla uyumludur. Yine de Ellis'in 2001 notuna göre kafese sığmayacak kadar büyük bir protein de GroEL'e tutunup bırakılarak kümelenmekten korunabilir; kurgudaki küçük artış bu yüzden sıfır değildir.

Kerner ve arkadaşlarının 2005 çalışmasına göre bakteride yaklaşık 250 protein GroEL'le etkileşir; çoğu tetik faktör ve Hsp70 ile de katlanabilir, GroEL'e mutlak bağımlı olanlar 85 dolayındadır.

Son rötuş ve tampon

Hsp90 başka bir aşamada çalışır. Saibil ile Malkeyeva ekibi onun yüklerini, yani müşterilerini (client), steroid hormon reseptörleri ve protein kinazları olarak sayar. Saibil'e göre steroid reseptörü hormonunu verimli bağlayabilmek için Hsp90'a tutunmalıdır; kinazları ise CDC37 adlı yardımcı getirir. Hücrenin sinyal proteinlerinin bir bölümü olgunluğa bu son basamakta ulaşır. Freeman ile Morimoto'nun deneyinde Hsp90 tek başına katlamamış, bozulmuş zinciri Hsp70'e devredilebilecek hâlde tutmuştu. Bu bağımlılık Hsp90'ı ilaç geliştirme çalışmalarının da hedefi yaptı; o alan bu dersin dışında kalıyor.

Küçük ısı şoku proteinleri ise hiç ATP harcamaz. Gu, Fan ve Yu'nun 2023 tarihli derlemesi memelide bu aileden on protein sayar ve kümelenmeyi ATP'den bağımsız bir yolla önlediklerini yazar. Ecroyd ekibinin 2023 raporu da onları ATP'siz tutucular (holdase) sınıfına koyar. Açılan zinciri sararak katlanmaya hazır bekletirler; zinciri sonra Hsp70 ile ortakları çözüp katlar. Bu aile bir tampona benzer.

Bu proteinlerin bolluğu da az değildir. Finka ile Goloubinoff'un 2013 meta-analizi on bir insan hücre hattında şaperonların toplam protein kütlesinin yaklaşık yüzde 10'unu oluşturduğunu, bunun yarısının Hsp90 ve Hsp70 ailelerine ait olduğunu buldu. Kurgu bir hücrenin bin birimlik protein kütlesinde 100 birim şaperon, onun da 50 birimi bu iki aile demektir.

Kazara ısınan inkübatör

Wikipedia'nın ısı şoku yanıtı maddesi ile De Maio ve arkadaşlarının 2012 yazısı keşfi Ferruccio Ritossa'ya bağlar. Ritossa Drosophila tükürük bezlerinin dev kromozomlarında kabarıkları (puff) inceliyordu. Biri inkübatörün sıcaklığını değiştirmişti ve kromozomlarda yeni bir kabarık deseni belirdi. Makale saygın bir dergiden geri çevrildi, 1962'de Experientia'da yayımlandı. De Maio ekibine göre ısıyla çoğalan proteinlerin kendisi on iki yıl sonra, 1974'te bulundu ve yanıtın başka canlılarda da işlediği anlaşıldı.

Gomez-Pastor, Burchfiel ve Thiele'nin 2018 derlemesine göre HSF1 olağan koşulda etkisiz, büyük olasılıkla tek kopya hâlindedir ve Hsp40, Hsp70, Hsp90 ile TRiC'e bağlı tutulur. Stres altında üçlü bir kompleks kurar, ısı şoku öğelerine bağlanır ve genleri açar. Wikipedia'nın HSF1 maddesi aynı geçişi anlatır. Derlemenin adlandırdığı şaperon titrasyonu modelinde açılmış proteinler çoğalınca şaperonlar onlara çekilir ve HSF1 serbest kalır. Yanıt, yeni yapılan Hsp70 ve Hsp90'ın HSF1'i yeniden bağlamasıyla söner.

Katlanmamış Protein Yanıtı dersinde ER'nin alarmını BiP'in zar algılayıcılarına tutunmasıyla okumuştuk. Sitozolün mantığı benzer: bekçi şaperon serbest kaldığında katlama kapasitesini artıran bir sinyal doğar. Kurgu jelde koyulaşan Hsp70 bandı, Hsc70'in sabit bandının yanında bu yanıtın izidir.

Defterdeki beş satır

Ilgın beş tüpün altına notlarını yazıyor: "Hsp40 + NEF + ATP: ışık döndü", "ATP yok: dönmedi", "GroEL: 61 kDa, sınırın üstü". Jelin yanına "Hsc70 sabit, Hsp70 2. saatte" ekliyor. Seniha Hanım birinci tüpü ışığa tutuyor; dipteki bulanıklık yerinde. "Bunu kimse kurtaramadı," diyor. "Hücre böyle bir zinciri ne yapar? Çarşamba onu işaretleyen etikete bakacağız."

Kendini sına

1. Hsp40'ı eksik tüpte ışık neden zar zor arttı? Hsp40'ın döngüdeki iki işini yazın.
2. Kırk kilodaltonluk katlanmış bir zincir GroEL odasının kaçta kaçını doldurur? Erickson formülünü ve 175 nm³'lük hacmi kullanın.
3. Freeman ile Morimoto'nun bulgusuna göre şaperonlar 42 °C'de yükü katlamak yerine ne yapar?
4. Küçük ısı şoku proteinleri ile Hsp70 arasındaki iş bölümünü ATP üzerinden açıklayın.
5. Hücrede Hsp70 çok fazla yapılsaydı ısı şoku yanıtı nasıl etkilenirdi? Şaperon titrasyonu modeliyle cevaplayın.

Bir sonraki derse köprü

Ubiquitin–Proteazom Sistemi dersi, şaperonların kurtaramadığı zincirin yoluna bakacak. ERAD'ın son adımında ve Parkin'in işaretlediği mitokondride karşılaştığımız ubikitin, E1, E2 ve E3 enzimlerinden oluşan bir zincirle yüke nasıl takılır? Lizin 48'den bağlanan poliubikitin zinciri neden bir yıkım işaretidir ve 26S proteazomun fıçı biçimli çekirdeği, kapağı yükü açmadan içeri alabilir mi?