Katalaz

Şişedeki kahverengi çözelti

Pazartesi, ocağın dördüncü haftası. Cuma rafa kaldırılan şişe yeniden tezgâhta: dördüncü kesirden arıtılmış, ışığa tutunca hafif kahverengiye çalan bir katalaz çözeltisi. Eren pipetin ucuyla bir damlayı seyreltik hidrojen peroksit dolu bir deney tüpüne bırakıyor. Sıvı bir anda beyazlaşıyor, köpük tüpün ağzına tırmanıyor. "Reaktif Oksijen Türleri dersindeki lam gibi," diyor, "yalnız bu kez bakteri yok, yalnız enzim var."

Mihriban Hanım kuvars küvetleri diziyor. Hidrojen peroksit morötesinde, 240 nanometrede ışık soğurur; peroksit yıkıldıkça soğurma düşer. Dört küvete 5, 10, 20 ve 40 milimol/L peroksit konuyor, her birine aynı miktarda enzim. Eren ilk saniyelerin eğimini okuyor: 0,5, 1, 2 ve 4 milimol/L bölü saniye. Peroksit ikiye katlandıkça hız da ikiye katlanıyor, en yüksek tüpte bile.

Bir de çok derişik peroksitli beşinci küvet hazırlanıyor. İlk dakikada eğim beklendiği gibi; birkaç dakika sonra ise kalan peroksitten hesaplanandan belirgin biçimde yavaş. "Enzim yoruluyor mu?" diye soruyor Eren. Mihriban Hanım cevap vermek yerine buzdolabından küçük bir NADPH şişesi çıkarıyor.

Bu sabahın soruları

Enzimin yapısından başlayıp iki peroksidin hangi ara ürün üzerinden suya ve oksijene döndüğünü izleyeceğiz. Eren'in küvetlerinin neden düz bir çizgi verdiği ve beşincisinin neden yavaşladığı dersin ortasını tutuyor; sonunda enzimin organele girişine ve eksikliğinin sessizliğine bakacağız.

Metin

Dörtlü bir hem enzimi

Oscar Loew bu enzime adını 1900'de verdi; Wikipedia ile Glorieux ve Buc Calderon'un 2024 Redox Biology derlemesi, Loew'ün onu bitkilerden memelilere pek çok canlıda bulduğunu aktarır. James Sumner ile Alexander Dounce 1937'de sığır karaciğerinden katalazı kristallendirdi; Nandi ve arkadaşlarının 2019 derlemesi de bu tarihi verir.

UniProt kaydına göre insan katalazının bir alt birimi 527 amino asitten oluşur ve yaklaşık 59.800 dalton gelir. Dört özdeş alt birim bir araya gelir: 4 × 59,8 ≈ 239 kilodalton. Nandi ekibi tetramerin kütlesini 220–240 kilodalton, Otera ile Fujiki 2012'deki çalışmalarında 240 kilodalton olarak verir.

Her alt birimin derininde bir hem oturur. Sitokromların aynı yapıyı taşıdığını Elektron Taşıyıcılar dersinde, demirin dört azotla tutunduğu düz porfirin halkasını da Alkan, Alken ve Aromatikler dersinde görmüştük. Prostetik grup adını ise L02-P06-M05-D08 dersinde proteine sıkı ve kalıcı tutunan kofaktöre vermiştik; katalazın hemi bunun bir örneğidir.

Her alt birimde ikinci bir bağlı molekül daha vardır. Kirkman ile Gaetani 1984'te PNAS'ta katalazı "dört sıkı bağlı NADPH molekülü taşıyan dörtlü bir enzim" olarak tanımladı; Nandi ekibi de etkin biçimin her alt birimde bir NADPH taşıdığını yazar. Bu NADPH tepkimeye girmez. Görevi, aşağıda Eren'in beşinci küvetinde göreceğimiz bozulmayı önlemektir.

Bileşik I üzerinden

Antioksidan Savunma dersinde katalazın 2H₂O₂ → 2H₂O + O₂ tepkimesinin bir dismutasyon olduğunu ve iki peroksidi sırayla işlediğini görmüştük. Sıranın ne olduğu, hemin demirinde kurulan bir ara üründe saklıdır.

İlk peroksit üç değerlikli demire yaklaşır. Peroksidin oksijenlerinden biri demirde kalır, öbürü iki hidrojenle su olarak ayrılır. Geride kalan yapıya bileşik I denir. Nandi ekibinin tarifiyle bu bir oksiferril türüdür: demir dört değerliliğe çıkmış, oksijene çift bağla tutunmuştur; eksik kalan bir elektron ise porfirin halkasından çekilmiş ve halka radikal katyon hâline gelmiştir.

İkinci peroksit bu kez elektron verici olur. İki elektronunu bileşik I'e aktarır, kendisi oksijen gazı olarak ayrılır; demir üç değerliliğe döner, halka onarılır ve ikinci bir su çıkar. Wikipedia da Sies'in 2017'deki derlemesi de aynı iki denklemi yazar. Sies ayrıca bileşik I'in 660 nanometre dolayındaki soğurma bandı sayesinde perfüze karaciğerde 1970'te doğrudan görüldüğünü anlatır: hücrede peroksit üretildiğinin ilk kesin kanıtlarından biri bu banttı.

Dört küvet neden düz bir çizgi verdi

Enzimlerin Katalitik Rolü dersinde Michaelis–Menten bağıntısını kurmuş, hızın substrat arttıkça bir tavana yatıştığını, Km'nin dokuz katında tavanın onda dokuzuna varıldığını görmüştük. Aynı derste Km'si 20 milimol/L olan kurgu bir enzimde substratı 5'ten 40'a çıkarmak hızı ancak yaklaşık 3,3 katına taşırdı. Eren'in küvetlerinde ise sekiz kat peroksit sekiz kat hız verdi.

Bunun nedeni katalazın substratı bir cepte bekletmemesidir. Bileşik I'i kuran da onu söndüren de aynı molekül olduğu için hız iki çarpışmanın sıklığına bağlıdır; ikisi de peroksit derişimiyle artar. Wikipedia peroksidin katalazla yıkımının birinci dereceden ilerlediğini, hızın peroksit derişimiyle orantılı olduğunu yazar. Glorieux ile Buc Calderon, enzim modelinin katalazın substratıyla hiç doymayacağını öngördüğünü aktarır. Switala ile Loewen 2002'de on altı farklı canlıdan katalaz arıtıp karşılaştırdı ve Michaelis–Menten davranışının yalnız düşük peroksitte yaklaşık olarak izlendiğini buldu; bu yüzden katalaz için yazılan Km ve Vmax değerlerinin "görünür" diye etiketlenmesi gerektiğini önerdi.

Doymayan bir enzimde "saniyede kaç devir" sorusunun cevabı da ölçülen derişime bağlanır. Antioksidan Savunma dersinde katalaz için bildirilen değerlerin saniyede 4 × 10⁷'ye çıktığını ve bir devrin 25 nanosaniye sürdüğünü görmüştük. Wikipedia'nın devir sayısı maddesi de en yüksek değeri böyle verir. Switala ile Loewen'in on altı enziminde ise en yüksek devir hızları saniyede 54.000 ile 833.000 arasında kaldı. Aralığın tepesinden 4 × 10⁷'ye 4 × 10⁷ ÷ 833.000 ≈ 48 kat var; tabanında bir devir 1 ÷ 54.000 ≈ 18,5 mikrosaniye sürer. Hangi sayı alınırsa alınsın katalaz bilinen en hızlı enzimler arasındadır, ama tek bir "kcat" değeri yoktur.

Düşük derişimdeki davranış ise hız sabitiyle anlatılır. Reaksiyon Hızı dersinde birinci dereceden bir tepkimede yarılanmanın kaç molekülle başlandığına bakmadığını görmüştük. Karpenko ekibi katalazın peroksitle hız sabitini 10⁷ M⁻¹s⁻¹ mertebesinde verir. Eren'in küvetlerine 10 nanomol/L enzim konduğunu varsayalım: etkin hız 10⁷ × 10⁻⁸ = 0,1 s⁻¹, yarılanma süresi 0,693 ÷ 0,1 ≈ 6,9 saniye. Dört küvetin hepsinde peroksidin yarısı aynı yedi saniyede biter; 20 saniye sonra e^(−2) ≈ 0,14'ü kalır. Başlangıç hızları da 0,1 × 5 = 0,5'ten 0,1 × 40 = 4 milimol/L bölü saniyeye uzanır.

Hidrojen Peroksit Metabolizması dersindeki iş bölümü bu çizgiden okunur. Peroksiredoksin mikromolün altında yakalar ama Seaver ile Imlay'in bakterisinde on mikromol dolayında doymuştu. Düşük derişimde katalaz, hız sabiti peroksiredoksininkini aşmayan ve organele kapalı bir enzimdir. Peroksit biriktikçe ise o tavan yokluğu öne çıkar: derişim iki katına çıktığında yıkılan miktar da iki katına çıkar. Peroksizomun kendi oksidazlarının bıraktığı yük tam bu ikinci rejime düşer.

Beşinci küvet ve NADPH

Eren'in yavaşlayan küveti başka bir yolu gösteriyor. Bileşik I ikinci bir peroksitle değil de tek bir elektronla karşılaşırsa demir dört değerlikli kalır ama halka onarılır. Bu biçime bileşik II denir ve peroksidi yıkamaz. Kirkman, Rolfo, Ferraris ve Gaetani'nin 1999'daki çalışması, bağlı NADPH'nin bileşik II'nin oluşmasını önlediğini, bu sırada NADP⁺'ya dönüşüp yenisiyle değiştirildiğini gösterdi; Nandi ekibi de NADPH'nin bu etkisiz biçimin oluşumunu engellediğini yazar. Switala ile Loewen'in karşılaştırmasında küçük alt birimli katalazlar yüksek peroksitte öngörülenden yavaş çalışıyordu. Mihriban Hanım'ın NADPH şişesi bu yüzden masada.

Peroksidatik yan iş

Bileşik I'i söndürmek için ikinci bir peroksit şart değildir. Peroksit azken yakında küçük bir hidrojen verici bulunursa, bileşik I onun iki elektronunu alır ve onu yükseltger. Sies bu tepkimeyi metanolle yazar ve karaciğerde peroksit üretiminin metanolle bileşik I'in titre edilerek ölçüldüğünü anlatır. Wikipedia formaldehit, formik asit, fenoller ve alkollerin de bu yolla yükseltgenebildiğini sayar. Etanolün karaciğerde hangi enzimlerle ne oranda yıkıldığı ileride ayrıca işlenecek.

Organele giriş

Peroksizom Yapısı dersinde matriks proteinlerinin çoğunun ucunda serin–lizin–lösin üçlüsünü, katlanmış yükün içeri alınabildiğini görmüştük. İnsan katalazı bu kurala uymaz. Purdue ile Lazarow 1996'da Journal of Cell Biology'de son dört amino asidin, yani lizin–alanin–asparagin–lösin dizisinin hedefleme için gerekli ve yeterli olduğunu gösterdi; UniProt da bu ucu "alışılmadık" diye işaretler. Sondan ikinci konumda bazik bir kalıntı yerine yüksüz asparagin vardır ve son üç harf tek başına yetmez. Ucu bozulan insan katalazı tamamen sitozolde kaldı; maya katalazındaki yedek iç sinyal insanda yoktur.

Dört parçalı enzimin hangi biçimde girdiği ise açık bir sorudur. Purdue ile Lazarow'un aktardığına göre sıçan karaciğerinde monomerler alınıyor, hem ve dörtlü yapı içeride tamamlanıyordu; Freitas ekibi 2011'de PEX5'in yalnız monomere bağlanıp onun birleşmesini engellediğini gösterdi. Middelkoop ekibi 1993'te insan deri fibroblastlarında tetramerin sitozolde bir saat içinde kurulduğunu bildirdi; Otera ile Fujiki de tetramerin sitoplazmada oluştuğunu ve PEX5 ile PEX13 etkileşimiyle alındığını savundu.

Yedekli bir savunma

Aerobik canlıların neredeyse tamamı katalaz taşır; Wikipedia ile Nandi ekibi aynı genellemeyi yapar. Buna karşın enzimin eksikliği insanda çoğu kez sessizdir. Japon kulak burun boğaz uzmanı Takahara 1948'de ilk akatalazemi hastalarını bildirdi; Wikipedia'nın aktardığına göre ağızdaki yaraya peroksit sürdüğünde köpük çıkmamıştı. MedlinePlus akatalazemili kişilerin çoğunun bu durumla ilgili hiçbir sağlık sorunu yaşamadığını yazar. Önceki dersteki tablo bunu açıklar: peroksiredoksinler ve glutatyon peroksidazlar peroksidin büyük kısmını katalaz olmadan da tüketir.

Küvetlerden deftere

Eren dört küvetin noktalarını bir çizgiyle birleştiriyor, ucuna "tavan yok" yazıyor. Altına "Fe³⁺ → bileşik I → Fe³⁺ + O₂", "6,9 s, her derişimde" ve "4 × 59,8 ≈ 239 kDa" ekliyor. Köpüklü tüpün yanına Entalpi dersindeki ideal gaz yaklaşımıyla bir hesap düşüyor: 1 milimol peroksitten yarım milimol oksijen çıkar; 25 °C'de, bir atmosfer basınçta bir mol gaz 0,082 × 298 ≈ 24,5 litre tuttuğu için 0,5 × 24,5 ≈ 12 mililitre. Mihriban Hanım NADPH eklenmiş beşinci küveti yeniden okutuyor; eğri bu kez daha geç bükülüyor.

"Peroksizomdan çıkan tek şey peroksit değil," diyor Mihriban Hanım. "Çarşamba yanındaki organele bakarız."

Kendini sına

1. 2 milimol peroksit katalazla tamamen yıkılırsa oda sıcaklığında ve bir atmosferde yaklaşık kaç mililitre oksijen çıkar?
2. Enzim derişimi 5 nanomol/L'ye inerse, Karpenko ekibinin hız sabitiyle yarılanma süresi kaç saniye olur? Başlangıç peroksidi iki katına çıkarsa bu süre değişir mi?
3. Bileşik I ile bileşik II arasındaki fark nedir? NADPH hangisinin oluşumunu önler?
4. Katalaz için tek bir kcat yazmanın neden yanıltıcı olabileceğini Switala ile Loewen'in bulgusuyla açıklayın.
5. Ucu bozulan insan katalazının tamamen sitozolde kalması, maya katalazıyla karşılaştırıldığında hangi farkı gösterir?

Bir sonraki derse köprü

Peroksizom–Mitokondri İletişimi dersi iki organelin nasıl iş paylaştığını soracak. Peroksizomda kısaltılan yağ asidi zinciri mitokondriye hangi karnitin esterleri biçiminde devredilir, peroksizomda biriken NADH hangi mekiklerle yeniden yükseltgenir? Drp1, Fis1 ve Mff gibi aynı bölünme proteinlerini paylaşan bu iki organel, peroksit ve redoks dengesini de birbirine bağlı mı tutar?