Otofaji ve Besin Algılama · Fonksiyonel Tıp Akademisi

Cuma, iki renk birden

Ocağın ilk cuması; Gümüşhane'de görüntüleme odasının perdeleri kapalı. Utku'nun mikroskop tablasına sıraladığı dört kaptaki hücreler iki işaret taşıyor. mTOR adlı kinaz kırmızı, TFEB adlı bir transkripsiyon faktörü (transcription factor) yeşil floresan proteine bağlı. Bir mavi boya da lizozomları gösteriyor.

Tam besiyerindeki kapta kırmızı, mavi noktaların üstüne oturmuş; yeşil sitoplazmaya yayılmış, çekirdek koyu. Elli dakika önce amino asitleri çekilen kapta tablo tersine dönmüş: kırmızı sitoplazmaya dağılmış, yeşil çekirdeği doldurmuş. Sayım yazılımı hücrelerin yüzde 75'inde yeşili çekirdekte buluyor; tam besiyerinde bu oran yüzde 10. Glukozu çekilen kapta yüzde 40, yalnız serumu çekilen kapta yüzde 30 çıkıyor.

Utku amino asitsiz kaba amino asitleri geri veriyor. On dakika sonra kırmızı yeniden mavi noktalarda. "Serumu çektiğimizde kapı açılmıştı," diyor. "Demek açlığın tek bir haberi yok." Firuze Hanım ekrana yaklaşıyor. "Haberi taşıyan birden fazla. Kimin nerede beklediğine bak."

Mekanizma

Bolluk işareti: mTORC1

Makrootofaji dersinde başlatıcı adımı ULK1 kompleksine bırakmış, ama kompleksi neyin harekete geçirdiğini açık bırakmıştık. Cevabın büyük kısmı bir frendir. Hosokawa ekibinin 2009 çalışması, ULK1, ATG13 ve FIP200'ün kararlı bir kompleks kurduğunu ve bu kompleksin besin durumuyla dağılmadığını gösterdi. Değişen, kompleksin fosfat yüküdür: besin varken mTORC1 kompleksin içine katılıp ULK1'i ve ATG13'ü fosforlar. Jung ekibi ile Ganley ekibinin aynı yıl çıkan makaleleri de bu iki hedefi bildirir ve lösin çekilince ya da mTOR engellenince fosfatların kalktığını yazar.

Fren yalnız tek bir enzime basmaz. Aynı kinaz, TFEB'i de fosforlar. Settembre ekibinin 2012 EMBO Journal çalışması TFEB'in lizozom zarında mTORC1 ile yan yana durduğunu, besin varken fosforlanınca etkisiz kaldığını gösterdi. Roczniak-Ferguson ekibi ve Martina ekibi aynı yıl fosfatın 211. sıradaki serine takıldığını, bu fosfatı tanıyan 14-3-3 proteinlerinin TFEB'i sitoplazmada tuttuğunu buldu.

Lizozom yüzeyinde iki anahtar

Amino asitler mTORC1'e bir bölme üzerinden ulaşır. Sancak ekibinin 2008 Science makalesine göre Rag adlı dört küçük GTPaz, amino asit varken mTORC1'e bağlanır; GTP'ye kilitlenmiş bir Rag taşıyan hücreler amino asit çekilince bile mTORC1'i kapatamaz. Rag'ler kinazı doğrudan uyarmaz, onu Rheb adlı etkinleştiricinin bulunduğu bölmeye götürür. Veziküler Trafik dersinde tanıdığımız Rab'ler gibi bu proteinler de GTP bağlıyken açık, GDP bağlıyken kapalıdır.

O bölmenin adını iki yıl sonra yine Sancak ekibi Cell'de koydu: lizozom yüzeyi. Ragulator adını verdikleri üç proteinli bir iskelet Rag'leri lizozoma bağlar. Kanıtın en temiz kısmı bir zorlamaydı. Raptor'a bir lizozom adresi eklenince mTORC1 amino asitlere duyarsız hâle geldi; Rag ve Ragulator'a artık ihtiyaç kalmadı, ama Rheb'e hâlâ vardı. Wikipedia'nın mTORC1 maddesi de aynı düzeni anlatır: amino asit kompleksi lizozoma getirir, orada bekleyen GTP bağlı Rheb onu açar. Biri yer, öteki açma işini görür; iki anahtar birlikte çevrilmeden kilit açılmaz.

Rheb'in kendi anahtarı büyüme etkenlerinden gelir. Zoncu ekibine göre yukarıdan gelen sinyallerin çoğu TSC1–TSC2 ikilisinde toplanır ve bu ikili Rheb'i kapatır. İnsülinden TSC'ye uzanan kol, PI3K–AKT–mTOR Yolu dersinin konusu olacak. Utku'nun serumsuz kabı bu kolun sustuğu durumdur: amino asit yerinde, ikinci anahtar eksik.

Lizozomal Asidifikasyon dersinde V-ATPaz'ı protonları lümene basan dönen bir pompa olarak izlemiştik. Zoncu ekibinin 2011 Science çalışması aynı pompayı amino asit algısının içinde buldu. V-ATPaz, Ragulator ile amino aside duyarlı biçimde etkileşir ve sinyal ancak pompa ATP yıkarak döndüğünde iletilir; pompanın lümeni asitleştirme yeteneği ise bu iş için gerekmez. Amino asitlerin lümende birikmesi gerektiği için ekip modele "içeriden dışarı" adını verdi.

Sitozolde de algılayıcılar var. Wolfson ekibinin 2016 Science makalesine göre Sestrin2 lösini bağlar ve bağlayınca Rag'leri dolaylı yoldan açan GATOR2'yi serbest bırakır; Saxton ekibinin aynı yılki yapı çalışması lösinin oturduğu cebi gösterir. Chantranupong ekibi ile Saxton ekibinin 2016 makaleleri arjinin için aynı işi CASTOR1'e verir.

Enerji azalınca: AMPK

Glukozsuz kapta haber başka bir kanaldan gelir. Hardie'nin 2018 derlemesi ve Hardie, Ross ile Hawley'nin 2012 Nature Reviews derlemesi, AMPK'yı hücrenin enerji algılayıcısı olarak tanımlar. AMP, ADP ve ATP aynı düzenleyici alt birime yarışarak bağlanır; ATP azalıp ötekiler arttıkça kinaz açılır.

Neden AMP? Hücrelerde bol bulunan adenilat kinaz 2 ADP ⇌ ATP + AMP tepkimesini dengeye yakın tutar ve bu tepkimenin denge sabiti 1'e yakındır; bunu hem Hardie 2018'de hem Wikipedia'daki adenilat kinaz maddesi kaydeder. Dengede AMP ≈ ADP² ÷ ATP olur. Kurgu bir havuzda 100 birim ATP, 10 birim ADP bulunsun: AMP = 100 ÷ 100 = 1. Şimdi ATP yüzde 10 düşsün, toplam nükleotit 111'de sabit kalsın. Denge yeniden kurulduğunda ATP 90, ADP 17,6, AMP 3,4 olur. ATP yalnız yüzde 10 azalmışken AMP üç buçuk katına çıkmıştır. Oranlarla bakınca kare açıkça görünür: ADP:ATP 0,10'dan 0,195'e, AMP:ATP 0,010'dan 0,038'e çıkar ve 1,95² ≈ 3,8'dir. Hardie bu kare ilişkisini AMP'yi düşen enerjinin çok daha duyarlı bir göstergesi yapan şey olarak anlatır.

Bu duyarlılığın eski bir adı var. Hardie ile Hawley'nin 2001 BioEssays makalesi ve Wikipedia, hücrenin enerji durumunu üç adenin nükleotidini birlikte hesaba katan bir sayıyla, enerji yüküyle (energy charge) ölçme fikrini 1960'larda Daniel Atkinson'a bağlar. AMPK o hipotezin canlı bir algılayıcısıdır.

Etkinleşen AMPK iki yönden iter. Kim, Kundu, Viollet ve Guan'ın 2011 Nature Cell Biology çalışması glukoz açlığında AMPK'nın ULK1'i doğrudan fosforlayıp etkinleştirdiğini, besin bolken ise mTOR'un ULK1'in başka bir serinini fosforlayıp AMPK ile ULK1'in buluşmasını bozduğunu gösterdi. Egan ekibinin aynı yıl Science'ta çıkan makalesi, AMPK'nın fosforlayamadığı bir ULK1 taşıyan hücrelerin açlıkta mitokondri düzenini koruyamadığını ve yaşayamadığını bildirdi. Öteki yönde AMPK freni kendisi sıkıştırır: Gwinn ekibinin 2008 Molecular Cell çalışmasına göre raptor'u fosforlar, Inoki ekibinin 2003 Cell makalesine göre de TSC2'yi etkinleştirip Rheb'i kapattırır. Kinazların ortak dili AMPK Yolu dersinde ayrıca işlenecek.

TFEB ve lizozom genleri

Fren kalkınca yeşil çekirdeğe geçer. Martina ekibine göre mTORC1 engellendiğinde TFEB 14-3-3'ten ayrılır ve hızla çekirdeğe taşınır. Settembre ekibinin 2012 çalışmasında açlık, mTORC1 engeli ve lizozom hasarı aynı sonucu verdi; Rag'ler bu yer değiştirme için hem gerekli hem yeterliydi. TFEB'siz hücrelerde lizozom ve otofaji genlerinin yanıtı bastırılmıştı.

Genlerin ortak bir dizi taşıdığını Sardiello ekibi 2009'da Science'ta gösterdi: lizozom genlerinin çoğu birlikte açılıp kapanır ve bunu TFEB düzenler. Palmieri ekibinin 2011 çalışması bu ağa CLEAR (Coordinated Lysosomal Expression and Regulation) adını yerleştirdi ve içine otofaji, ekzositoz ve endositozla ilgili genleri de kattı. Böylece açlık yalnız kese kurdurmaz, keseleri yıkacak lizozomları da çoğaltır.

Açlık uzayınca

Şaperon Aracılı Otofaji dersinde o yolun makrootofaji tepe yaptıktan sonra, saatler süren besin yokluğunda yükseldiğini okumuştuk. Sıra burada bir döngüye bağlanır. Yu ekibinin 2010 Nature çalışmasında sıçan böbrek hücrelerinde mTOR açlığın başında susturuldu, ama açlık uzayınca yeniden açıldı. Yeniden açılma otofajiye ve otolizozomdaki yıkım ürünlerine bağlıydı: otolizozomda serbest kalan yapı taşları freni yeniden sıkıyordu. Açılan mTOR otofajiyi yavaşlattı ve otolizozomdan uzanan borucuklardan yeni lizozomlar koparttı. Chen ile Yu'nun 2018 derlemesi bu son adımı otofajik lizozom yeniden oluşumu diye adlandırır.

Yaygın yanlış"mTOR kötüdür, otofaji iyidir; biri kapandıkça öteki kazanır." mTORC1 bolluk sürerken büyümeyi ve onarımı yürütür; uzayan açlıkta yeniden açılması lizozom stokunu yeniler.

Doğrusu

Otofaji de sınırsız artınca hücre kendi yapı taşlarını tüketir. Hücrenin işi bir kazananı seçmek değil, ikisi arasında besine göre gidip gelmektir.

Bu algılayıcılardaki bozulmaların kanserde, metabolik hastalıklarda ve sinir sistemi hastalıklarında payı hâlâ araştırma konusudur.

Modelin sınırı

Kültür kabında besin çekmek ile bir insanın yemek yememesi aynı şey değildir. OpenStax'te vücudun metabolik durumlarını anlatan bölüm ve Wikipedia'daki açlık yanıtı (starvation response) maddesi şunu anlatır: kan glukozu dar bir aralıkta tutulur; düşünce glukagon yükselir, karaciğer glukoz üretir, vücut proteinlerinin yıkımı kana amino asit verir. Dokudaki hücre, kaptaki hücrenin gördüğü ani ve tam yokluğu görmez.
AMP hesabı adenilat kinazın dengede olduğunu ve toplam nükleotidin sabit kaldığını varsayar. Hardie ile Lin'in 2017 derlemesi ve Zhang ekibinin aynı yılki Nature çalışması, glukoz çekilen bazı hücrelerde AMPK'nın AMP ya da ADP oranı değişmeden, lizozom yüzeyinde kurulan ayrı bir kompleksle açıldığını gösterdi.
Floresanla işaretli proteinler çoğu kez hücreye dışarıdan eklenir; eklenen kopyanın dağılımı hücrenin kendi proteininkinden farklı olabilir.
İki anahtar modeli Rheb'in lizozomda nasıl tutulduğunu ve büyüme etkeni kolunun ayrıntısını kapsamaz.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
Kültür kabında besin çekilince bu algılayıcıların değişmesi, bir beslenme biçiminin, aç kalınan sürenin ya da herhangi bir maddenin insanda aynı değişikliği yaptığını ya da sağlığa yararlı olduğunu göstermez.

Işıklar kapanmadan

Utku eşlerden okuduğu akışları deftere geçiyor: tam besiyeri 6, amino asitsiz 18, glukozsuz 11, serumsuz 9 nokta/saat. Altına "ATP −%10 → AMP ×3,4" ve "1,95² ≈ 3,8" yazıyor, yanına iki anahtarlı bir kilit çiziyor.

Firuze Hanım çekmeceden kalıtsal bir lizozom kusuru taşıyan hasta hücrelerinin şişesini çıkarıyor. "Bunların lizozomu aç değil, tok," diyor. "Bir enzimi eksik; yıkamadığını içinde tutuyor. Pazartesi ona geçeriz."

Kendini sına

Kurgu havuzda ATP yüzde 20 düşerse AMP kaç katına çıkar? AMP ≈ ADP² ÷ ATP ilişkisini ve sabit toplamı kullanarak adım adım bul.
Raptor'una lizozom adresi eklenmiş bir hücrede amino asitler çekilince mTORC1 ne yapar? Bu hücrede Rheb susturulursa sonuç değişir mi?
TFEB'in 211. serini fosfat alamayacak biçimde değiştirilmiş bir hücrede besinli kapta yeşil nerede görülür?
Yu ekibinin bulgusu açlığın sürekli ve tek yönlü bir otofaji artışı olmadığını hangi gözlemle ortaya koyar?

Bir sonraki derse köprü

Lizozomal Depo Hastalıkları dersi lizozomun dolup taştığı durumu soracak. Tek bir asit hidrolaz ya da bir zar taşıyıcısı eksik olunca yıkılamayan madde lümende nasıl birikir? Veziküler Trafik dersindeki mannoz 6-fosfat etiketi, bir hücrenin dışarı verdiği enzimin komşu hücrece geri alınmasını nasıl sağlar? Dolu lizozom, bu derste gördüğümüz TFEB ve mTORC1 dengesine nasıl geri etki eder?