Şaperon Aracılı Otofaji

Çarşamba, mor ışıktan sonra

Ocağın ilk haftası, çarşamba. Gümüşhane'deki laboratuvarda Utku dört kabı ısıtmalı tablaya diziyor. Hücrelerin hepsi beş harflik bir dizi taşıyan, mor ışık görünce maviden yeşile kalıcı olarak dönen bir haberci protein yapıyor. Sabah her kaba on dakika mor ışık tutulmuş; ekranda yalnız o an yeşile dönen moleküller izleniyor.

Serumlu kapta yeşil, sitoplazmaya düz bir sis gibi yayılmış. Pazartesi akşamı serumu çekilen ikinci kapta sis tanelenmiş; sayım yazılımı hücre başına 3'ten 17'ye çıkan nokta buluyor ve noktalar lizozom işaretinin üstüne oturuyor. Üçüncü kapta serum yine çekilmiş ama LAMP2A adlı zar proteini susturulmuş; sis yerinde duruyor. Dördüncü kapta haberci dizisinin son harfi, glutamin, alanine çevrilmiş; serumsuz olduğu hâlde orada da tek nokta yok.

"Kese yok," diyor Utku. "Protein lizozoma tek başına gidiyor." Firuze Hanım buzdolabından karaciğerden arıtılmış lizozomların durduğu iki tüp alıyor. "Tek başına gitmiyor. Kimin elinden tuttuğunu öğleden sonra cam tüpte göreceğiz."

Mekanizma

Kesesiz yol

Makrootofaji dersinde Parzych ile Klionsky'nin üç otofaji türü ayırdığını görmüş, makrootofajiyi çift zarlı kesesiyle, mitofajiyi de onun seçici bir kolu olarak izlemiştik. Üçüncü türde kese hiç kurulmaz. Kaushik ile Cuervo'nun Nature Reviews MCB'de 2018'de çıkan derlemesine göre yük protein protein seçilir ve lizozom zarından doğrudan geçer. Kaushik ile Cuervo'nun 2009 yöntem derlemesi de yolu öteki türlerden bu iki özellikle ayırır.

Beş harflik adres

Yolun ipucu ribonükleaz A'dan geldi. Dice'ın 1990 Trends in Biochemical Sciences makalesi, serumsuz kültür hücrelerinde ve aç hayvan dokularında lizozomun Lys-Phe-Glu-Arg-Gln, kısaca KFERQ dizisine benzeyen bölgeler taşıyan proteinleri seçtiğini özetler. Dice ile Terlecky'nin aynı yılki derlemesi bu beşliyi ribonükleaz A'nın 7. ile 11. kalıntıları olarak verir; Kirchner ekibinin 2019 PLoS Biology çalışması da motifin bu proteinin baş ucunda bulunduğunu yazar.

Kural harfleri değil, harflerin sınıfını sayar. Kirchner ekibine ve Kaushik ile Cuervo'ya göre beşlinin bir ucunda glutamin durur. Kalan dört konumda bir ya da iki artı yüklü kalıntı (lizin veya arginin), bir ya da iki yağ seven kalıntı (fenilalanin, izolösin, lösin ya da valin) ve tek bir eksi yüklü kalıntı (aspartat ya da glutamat) bulunur. Utku'nun dördüncü kabındaki dizi glutaminini yitirince motif olmaktan çıkmıştı.

Kural ne kadar gevşek? Kurgu bir hesapta her amino asit eşit sıklıkta geçsin. Glutamin bir uçta sabitken dört konuma bir artı yüklü, iki yağ seven ve bir eksi yüklü kalıntı 4! ÷ 2! = 12 farklı sırayla dizilir; harf seçenekleriyle 12 × 2 × 4 × 4 × 2 = 768 dizi eder. İki artı yüklü, bir yağ seven ve bir eksi yüklü kalıntıyla yine 12 sıra ve 12 × 2 × 2 × 4 × 2 = 384 dizi çıkar. Toplam 1152; glutamin öbür uçta da durabildiği için 2304. Bütün beşlilerin sayısı 20⁵ = 3,2 milyon olduğundan rastgele bir beşlinin motif olma olasılığı 2304 ÷ 3.200.000 ≈ 0,00072, yani kabaca 1400'de bir.

Dört yüz kalıntılık bir proteinde 396 beşli pencere vardır. En az birinin motif olma olasılığı 1 − (1 − 0,00072)^396 ≈ 0,25. Gerçek sayı daha yüksek: Kirchner ekibi gözden geçirilmiş 20.165 insan proteininin yüzde 46'sında en az bir kanonik motif buldu, Kaushik ile Cuervo memeli proteomu için yaklaşık yüzde 40 yazar. Proteinler rastgele harf dizisi değildir; hesabın gösterdiği, kuralın seyrek değil yaygın bir işaret tarif ettiğidir.

Motif sonradan da tamamlanabilir. Kaushik ile Cuervo'ya göre kanonik kalıntılardan yalnız dördünü taşıyan bir dizide serin, treonin ya da tirozinin fosforlanması eksi yükü ekleyip motifi tamamlar; lizin asetilasyonu da benzer biçimde iş görür. Kirchner ekibi insan proteinlerinin yüzde 20'sinde kanonik motif olmadığı hâlde fosforlanmayla doğabilecek bir motif, yüzde 9'unda yalnız asetilasyonla doğabilecek bir motif saydı. Motif taşımak bir proteini bu yolun yalnız adayı yapar.

Sitozoldeki eşlikçi

Protein Katlanması dersinde ER lümenindeki BiP'i Hsp70 ailesinden bir şaperon olarak tanımış, ATP ile açılıp kapanan bağlanma cebini izlemiştik. Chiang, Terlecky, Plant ve Dice 1989'da Science'ta, motif bölgelerine bağlanan 73 kilodaltonluk bir proteinin aynı aileden olduğunu, serum çekilince hücredeki derişiminin birkaç kat arttığını bildirdi. Bu, BiP'in sitozoldeki akrabasıdır. Ailenin ortak döngüsü Şaperon Proteinleri dersinde işlenecek.

Hsc70'in bir bölümü lizozomun içindedir. Agarraberes, Terlecky ve Dice 1997'de JCB'de lizozomla ilişkili bu Hsc70'in çoğunun lümende durduğunu buldu; hücrelere içeri alınan bir antikorla onu bağladıklarında serumsuzlukta artan protein yıkımı tamamen durdu. Kaushik ile Cuervo da lümen Hsc70'i olmayan lizozomun bu yolu yürütemediğini yazar.

Kapı: LAMP2A

Lizozomal Asidifikasyon dersinde LAMP ailesini lümene bakan şeker örtüsüyle tanımıştık; kapıyı kuran üye de bu ailedendir. Wikipedia'nın LAMP2 maddesine ve Kaushik ile Cuervo'ya göre LAMP2 geni alternatif eklemeyle üç biçim verir: A, B ve C. Biçimlerin karboksil ucundaki bölümü, zar içi parçası ve sitozole bakan kısa kuyruğu dahil, farklıdır. Yalnız A bu yolun alıcısıdır. Cuervo ile Dice 1996'da Science'ta yükün 96 kilodaltonluk bir lizozom zar proteininin sitozol kuyruğuna bağlandığını göstermişti; bu protein LAMP2A'ydı.

Kapı kalıcı değildir. Bandyopadhyay ve arkadaşlarının 2008 Molecular and Cellular Biology çalışmasına göre yük yalnız tek kopya hâlindeki LAMP2A'ya bağlanır, geçiş ise yüksek molekül ağırlıklı bir çoklu kompleks ister. Lümen yanındaki HSP90 LAMP2A'yı kararlı tutar, Hsc70 kompleksin sökülmesine katılır. Bandyopadhyay ile Cuervo'nun aynı yılki yorumu bunu zarda kalıcı bir delik değil, yalnız geçiş süresince açılan bir kapı diye özetler.

Geçebilmek için yük açılmalıdır. Kaushik ile Cuervo'nun 2018 derlemesine göre açılamayan yapay bir yük zara bağlanabildi ama içeri geçemedi; 2009 yöntem derlemesi de açılmış zincirin zarı ATP'ye bağlı biçimde geçtiğini yazar. Lümendeki Hsc70 zinciri içeri çeker ya da geri kaymasını önler, lümende de Lizozomal Asidifikasyon dersinde tanıdığımız asit hidrolazlar onu parçalar.

Cam tüpte alım

Firuze Hanım'ın tüpleri girişi sayıya çevirir. Kaushik ile Cuervo'nun yöntem derlemesindeki düzende arıtılmış lizozomlar motifli bir yükle karıştırılır, çöktürülür ve üzerlerindeki yük ölçülür. Lümen proteazları çalışırsa içeri giren yük hemen yıkılır; ölçülen yalnız zara bağlı olandır. Proteaz engelleyici verilirse içeri giren de korunur ve bağlıyla birlikte ölçülür. Alım ikisinin farkıdır. Bu, Makrootofaji dersinde yıkımı durdurup birikimi sayan akış mantığının organel ölçeğindeki karşılığıdır.

Kurgu sayılarla: engelleyicisiz tüpte eklenen yükün yüzde 12'si, engelleyicili tüpte yüzde 40'ı lizozomlarla çöksün. Bağlanan 12, içeri alınan 40 − 12 = 28'dir.

Hızı belirleyen adım

Kaushik ile Cuervo LAMP2A'yı yolun hız sınırlayıcı bileşeni sayar; zardaki miktarı ve dinamiği akışı ayarlar. Wikipedia'nın maddesi de sınırlayıcı adımı yükün LAMP2A'ya bağlanması olarak verir.

Lipit Salları dersinde zarın kolesterol ve sfingolipitçe zengin, ayrışan küçük alanlar taşıyabileceğini görmüştük. Kaushik, Kiffin ve Cuervo'nun 2007 Autophagy yorumuna göre LAMP2A lizozom zarında ayrık lipit mikroalanlarına bölünür; yıkımı, çoklu kompleks kurması ve zara geri dönüşü bu alanlarda düzenlenir. Kaushik ile Cuervo 2018'de alıcının bu alanlarda kesilerek yıkıldığını ekler; Cuervo ile Dice'ın 2000 Traffic çalışması da kesimin en az iki proteaz istediğini yazar.

Yaşla değişen de burasıdır. Cuervo ile Dice 2000 tarihli JBC makalesinde 22 aylık sıçanların karaciğer lizozomlarında yükün hem bağlanmasının hem içeri alınmasının azaldığını, LAMP2A düzeyinin ilerleyici biçimde düştüğünü, sitozoldeki Hsc70'in ise değişmediğini bildirdi; geç pasajdaki insan fibroblastlarında da LAMP2A azalmıştı. Kiffin ekibinin 2007 J Cell Sci çalışmasına göre LAMP2A'nın yazılma hızı yaşla değişmez, değişen alıcının lizozomdaki kararlılığıdır.

Kapıyı tıkayan yük

Seçici bir kapı, yanlış yükle tıkanabilir. Cuervo, Stefanis, Fredenburg, Lansbury ve Sulzer 2004'te Science'ta, Parkinson hastalığıyla ilişkilendirilen α-sinükleinin olağan biçiminin bu yolla lizozoma alınıp yıkıldığını gösterdi. Hastalıkla ilişkili iki değişik biçimi LAMP2A'ya bağlandı ama içeri geçmedi; hem kendi yıkımlarını hem öteki yüklerinkini engelledi. Kaushik ile Cuervo da bu biçimlerin zar bileşenleriyle olağan dışı etkileştiğini aktarır. Bulgu bir hücre mekanizmasıdır, hastalığın nedenini açıklamaz; kümelenmenin kendisi Agregasyon ve Amiloid dersinin konusu olacak.

Açlıkta bu yolun zamanlaması da kendine özgüdür: Kaushik ile Cuervo ve Wikipedia, makrootofaji tepe yaptıktan sonra, saatlerce süren besin yokluğunda yükseldiğini yazar.

Modelin sınırı

• Motif hesabı yirmi amino asidin eşit sıklıkta geçtiğini ve pencerelerin bağımsız olduğunu varsayar. İkisi de doğru değildir; hesap yalnız ölçeği gösterir.
• Bir dizide motif bulunması proteinin yüzeyde, şaperonun erişebileceği yerde durduğunu göstermez.
• Alım deneyi lizozomların arıtmada bozulmadığını ve engelleyicinin bütün proteazları durdurduğunu varsayar.
• Yaşla azalma kemirgen lizozomlarında ve kültür hücrelerinde gösterildi. Bu gözlem bir yaşlanma kuramı değildir; azalmanın yaşlanmanın nedeni mi sonucu mu olduğu bu verilerle ayrılamaz.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Motifi, Hsc70'i ya da LAMP2A'yı adıyla anarak hücre temizliğini hızlandırdığı veya yaşlanmaya karşı otofajiyi artırdığı söylenen takviyeler, peptit ürünleri ve açlık programları bu kanıttan pay alamaz. Kültür kabında ve kemirgen lizozomunda ölçülen geçişin böyle bir ürünle insanda hızlandığını gösteren veri yoktur.

Tüpler buza dönünce

Utku deftere "2304 ÷ 3,2 milyon, 400 kalıntıda ≈ 0,25" ve "bağlı 12, alınan 28" yazıyor; altına tek kopyaların yük gelince halka olup yeniden dağıldığı küçük bir LAMP2A çizimi ekliyor.

Firuze Hanım serumsuz kabın noktalarına bakıyor. "Serumu çektik, kapı açıldı," diyor. "Ama hücre serumun yokluğunu nereden biliyor? Amino asit azalınca, enerji düşünce kimin haberi oluyor?"

Kendini sına

1. "QKDLV" ve "QKFEA" dizilerinden hangisi KFERQ benzeri motif kurallarına uyar? Uymayanın hangi kuralı bozduğunu yaz.
2. Eşit sıklık varsayımıyla 200 kalıntılık bir proteinde en az bir motif bulunma olasılığı yaklaşık kaçtır? Sonucu 400 kalıntılık proteinle karşılaştır.
3. Alım deneyinde engelleyicisiz tüpte yüzde 15, engelleyicili tüpte yüzde 15 yük ölçülürse ne sonuç çıkarırsın? Hangi adım aksamış olabilir?
4. Açılamayan bir yük LAMP2A'ya bağlanabildiği hâlde neden lümende bulunmaz?

Bir sonraki derse köprü

Otofaji ve Besin Algılama dersi hücrenin açlığı nasıl fark ettiğini soracak. Lizozom yüzeyindeki mTORC1 amino asitleri Rag GTPazlar aracılığıyla nasıl okur ve besin varken otofajiyi nasıl frenler? Enerji azalınca AMPK, ULK1'i hangi yönden etkiler; TFEB çekirdeğe gidip lizozom genlerini nasıl açar ve uzayan açlıkta otofaji türleri hangi sırayla devreye girer?