Makrootofaji

Cuma, sayılan yeşil noktalar

Aralığın son cuması, yılın bitmesine birkaç gün kala. Gümüşhane'deki laboratuvarın koridoru boşalmış; ısıtmalı tabladaki hücreler LC3 adlı bir proteini yeşil floresan proteine bağlı olarak taşıyor. Olağan besiyerinde yeşil, sitoplazmaya sisi andıran bir parıltıyla dağılmış. Amino asitleri çekilmiş kapta aynı sis iki saatte belirgin noktalara toplanmış.

Sayım yazılımına göre olağan kapta hücre başına 8, amino asitsiz kapta 22 nokta. Üçüncü kaptaki hücrelerde, kesecikleri lizozomla kaynaştıran bir SNARE proteini susturulmuş; orada 30 nokta var, üçünün en kalabalığı. Firuze Hanım her kabın yanına bir eşini koymuş ve çarşamba kullandıkları, lizozom pompasını durduran maddeden eklemiş. İki saat sonra eşlerde sayılar 20, 58 ve 33.

"Üçüncü kabı en çok otofaji yapan kap sanmıştım," diyor Utku. "Oysa engelleyiciye neredeyse hiç tepki vermiyor." Firuze Hanım yan ekrana elektron mikroskobu baskısını açıyor: iki ince zarla çevrili bir kesenin içinde ribozom taneleri ve bir mitokondri parçası. "Sayı sana ne kadar kese olduğunu söyler. Kaç tanesinin yola çıktığını söylemez."

Bu derste ne olacak

Kelimenin ve keşfin tarihinden kesenin basamak basamak kuruluşuna geçeceğiz. Zarın nereden geldiğini lipit hesabıyla soracak, yükün nasıl seçildiğini göreceğiz. En sonda Utku'nun sayılarına dönüp nokta sayısıyla akışı ayıracağız.

Mekanizma

Kendini yiyen hücre

NobelPrize.org'un 2016 bildirisi kelimeyi Yunanca "kendi" ve "yemek" sözcüklerine bağlar ve adı lizozomu bulan Christian de Duve'ün koyduğunu yazar; Wikipedia'nın otofaji maddesi de adı de Duve'e verir. Parzych ile Klionsky'nin 2014 derlemesi memeli hücresinde üç otofaji türü ayırır. Mikrootofajide lizozom zarı içe çöker ya da dışa uzanıp yükü doğrudan kavrar. Şaperon aracılı otofaji zarlı bir yapı kullanmaz, belirli bir dizi taşıyan proteinleri tek tek içeri alır. Wikipedia makrootofajiyi ana yol diye anar; bu ders onu ele alır.

Protein Katlanması dersinde ERAD'ın katlanamayan zinciri tek tek sitozole çıkardığını izlemiştik. Nobel bildirisi proteazomun proteinleri teker teker yıktığını, ama büyük kompleksleri ve yıpranmış organelleri açıklamadığını not eder; o boşluğu makrootofaji doldurur.

Ohsumi'nin mayası

Nobel bildirisine göre Yoshinori Ohsumi 1988'de kendi laboratuvarını kurduğunda mayanın vakuolüne, lizozomun karşılığı olan organele yöneldi. Otofajinin mayada var olup olmadığı bile belirsizdi. Akıl yürütmesi şuydu: vakuolde yıkım durursa içeri taşınan keseler birikmeli ve görünmeliydi.

Deneyi Takeshige ve arkadaşlarının 1992'de JCB'de çıkan makalesi anlatır. Vakuol proteazlarından yoksun maya besinsiz ortama alındı. Bir saat sonra vakuolde Brown hareketiyle kıpırdayan birkaç küre belirdi, üç saatte küreler vakuolü neredeyse doldurdu. Elektron mikroskobunda içlerinde ribozom, granüllü ER ve mitokondri görüldü; çapları 400 ile 900 nanometre arasındaydı. Ekip onlara otofajik cisimcik adını verdi.

Tsukada ile Ohsumi'nin 1993 tarihli FEBS Letters makalesi bu görüntüyü bir taramaya çevirdi. Cisimcik biriktiremeyen bir mutant ışık mikroskobuyla bulundu, ardından 75 mutant daha seçildi. Hepsi 15 gen grubuna düştü. Nobel bildirisi de 15 geni ve bulgunun bir yıl içinde geldiğini aynı biçimde aktarır. 2016 Nobel'i fizyoloji ya da tıp dalında yalnız Ohsumi'ye verildi.

Bir kesenin kuruluşu

Parzych ile Klionsky kuruluşu art arda gelen basamaklarla anlatır. Başlatıcı adım ULK1 kompleksinindir. Ardından bir lipit kinazı gelir: sınıf III fosfatidilinozitol 3-kinaz VPS34, Beclin 1 ve ATG14 ile bir kompleks kurar ve zarda fosfatidilinozitol 3-fosfat, kısaca PI3P üretir. Bu işaretli zar parçası çekirdeklenme noktasıdır.

Zarın uzamasında iki proteinin işi yakın zamanda netleşti. Valverde ve arkadaşlarının 2019 JCB çalışması ile Osawa ve arkadaşlarının aynı yılki makalesi ATG2'yi ER ile büyüyen zarın ucu arasında köprü kuran ve bir seferde onlarca fosfolipit taşıyan bir lipit aktarım proteini olarak tanımlar. Matoba ve arkadaşları 2020'de, zara gömülü tek otofaji proteini olan ATG9'un bu lipitleri sitozol yaprağından öbür yaprağa çeviren bir karıştırıcı (scramblase) olduğunu gösterdi.

İki ubikitin benzeri bağlanma sistemi uzamayı destekler. Parzych ile Klionsky'ye göre ATG12, ATG5'e kovalent bağlanır ve bu çift ATG16L1 ile bir kompleks kurar. Öteki sistemde LC3, yani mayadaki Atg8'in memeli karşılığı, ATG4 tarafından kesilir, ATG7 ve ATG3 adlı enzimlerden geçer ve ucundaki glisinle fosfatidiletanolamine bağlanır. Bu son adıma ATG12–ATG5–ATG16L1 yardım eder. Wikipedia'nın otofagozom maddesi de lipitlenmiş LC3'ün kese zarına tutunduğunu yazar.

Kapanma ve kaynaşma

Endozomal Sistem dersinde ESCRT makinesinin tomurcuğun boynunu içeriden kestiğini görmüştük. Takahashi, Opozda ve Wang'ın 2026 derlemesi fagoforun kapanmasında da ESCRT'yi anar; Hamamoto ve arkadaşlarının 2024 çalışmasında ESCRT-I'in bir bölgesi değiştirilmiş farelerde kapanma bozuldu ve yığın otofajinin akışı aksadı.

Kapanan kesenin dış zarı lizozomla kaynaşır. Ekzositoz dersinde tanımladığımız SNARE demeti burada da iş görür. Itakura, Kishi-Itakura ve Mizushima'nın 2012 Cell makalesine göre syntaxin 17 yalnız tamamlanmış otofagozomun dış zarına yerleşir, açık fagoforda yoktur; lizozom yarım bir keseyle bu yüzden kaynaşmaz. Syntaxin 17 azaltılınca otofagozomlar yıkılmadan birikir. Hegedűs ekibinin 2013 yorumu bu rolün sinekte de korunduğunu yazar. Utku'nun üçüncü kabı budur.

Kaynaşmadan doğan otolizozomda iç zar ve yük, Lizozomal Asidifikasyon dersinde izlediğimiz asit hidrolazlarca parçalanır. Parzych ile Klionsky'ye göre yapı taşları lizozom zarındaki taşıyıcılarla sitoplazmaya geri verilir ve yeni sentezde ya da enerji için kullanılır.

Zar nereden geliyor

Firuze Hanım'ın baskısındaki kese bir mikrometre çaplı olsun. Tek küre yüzeyi 4 × π × 500² ≈ 3,14 milyon nm² eder. Otofagozomun iki zarı var ve her biri iki yapraklı bir çift tabaka; aradaki dar boşluğu ihmal edersek dört yaprak 12,6 milyon nm² tutar. Fosfolipit Çift Tabaka dersinde her lipide ayırdığımız 0,65 nm² ile bu 12,6 milyon ÷ 0,65 ≈ 19 milyon lipit eder. ATG2 bir seferde onlarca lipit taşıyorsa tek bir kese yüz binlerce aktarım ister.

Bu lipitlerin kaynağı çözülmedi. Parzych ile Klionsky konuyu "çok tartışmalı" bulur ve plazma zarını, ER'yi, Golgi'yi ve mitokondriyi aday sayar. Wikipedia'nın otofagozom maddesi geri dönüşüm endozomlarını da ekler.

Yığın ve seçici yük

Parzych ile Klionsky makrootofajinin sitoplazmayı seçmeden, yığın hâlinde de alabildiğini yazar. Aynı derleme seçici bir yolu da anlatır: SQSTM1, yaygın adıyla p62, ubikitinle işaretlenmiş protein kümelerine tutunur ve LC3-II'ye bağlanarak onları fagoforun içine çeker. Pankiv ve arkadaşlarının 2007 çalışması bu bağlanmayı p62'nin 22 kalıntılık, korunmuş bir dizisine yerleştirdi; Klionsky'nin kılavuzu bu tür dizilere LC3'le etkileşen bölge, LIR, der.

Seçici türler hedefe göre adlanır: kümelenmiş proteinlerde agregafaji, hücreye girmiş bakterilerde ksenofaji, mitokondride mitofaji; derleme de kılavuz da bu adları kullanır.

Nokta sayısı ve akış

Klionsky ve ortaklarının 2021'de dördüncü baskısı çıkan ölçüm kılavuzu Utku'nun hatasına karşı baştan uyarır. Elektron mikroskobunda, yeşil LC3 noktalarında ya da jeldeki LC3-II bandında görülen bir birikim, otofagozom yapımının artmasından da yıkımının yavaşlamasından da doğabilir. Kılavuz ikisini ayırmak için LC3-II'nin lizozom yıkımı çalışırken ve engellenmişken karşılaştırılmasını önerir.

Yıkım durunca kurulan her kese birikir; iki sayının farkı iki saatte kurulanlardır. Olağan kapta 20 − 8 = 12 nokta, saatte 6. Amino asitsiz kapta 58 − 22 = 36, saatte 18. SNARE'si susturulmuş kapta 33 − 30 = 3, saatte 1,5. En kalabalık kap en yavaş akandır: keseler kuruluyor ama lizozoma ulaşamıyor, engelleyicinin durduracağı bir yıkım zaten yok.

Bir mikrometrelik kese π × 0,5³ × 4/3 ≈ 0,52 µm³ sitoplazma tutar. Amino asitsiz kaptaki akış saatte 18 × 0,52 ≈ 9,4 µm³ taşır. Kurgu hücremizin sitoplazması 2000 µm³ olsun: saatte yaklaşık %0,5, aynı hız sürerse bir günde %11 dolayı eder. Yüzdeler kurgu sayılardan çıkar; gösterdikleri yalnız ölçektir.

Öğleden sonraki düzenekte, Kimura, Noda ve Yoshimori'nin 2007 çalışmasındaki gibi, LC3 hem kırmızı hem yeşil bir floresan proteine bağlı. Yeşil ışık lizozomun asidinde söner, kırmızı dayanır. Sarı nokta henüz kaynaşmamış otofagozom, yalnız kırmızı nokta otolizozomdur. Klionsky'nin kılavuzu akışı sarının azalıp kırmızının artmasıyla okur. Amino asitsiz kapta ekran kırmızıya döner; üçüncü kapta sarı kalır.

Otofaji yolundaki bozulmalar sinir sistemi hastalıkları, kanser ve enfeksiyonlarla ilişkili olarak araştırılmaktadır.

Modelin sınırı

• Akış hesabı engelleyicinin yıkımı tam durdurduğunu ve kese yapımını değiştirmediğini varsayar. Uzun bekleme bu iki varsayımı da zorlar.
• Kılavuza göre floresanlı LC3, p62 aracılığıyla otofajiyle ilgisiz protein kümelerine de takılabilir; o noktalar otofagozom sanılabilir.
• Zarın kaynağı ve kapanmanın ayrıntısı hâlâ tartışılıyor. Lipit hesabı kesenin kusursuz bir küre olduğunu ve iki zarın aynı büyüklükte kaldığını kabul eder.
• Mayadan memeliye geçiş birebir değildir. Kılavuza göre hayvan hücresinde lizozomlar otofagozomdan küçük olduğu için mayadaki gibi otofajik cisimcik görülmez; Ohsumi'nin görsel ipucu memeli kabında kurulamaz.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Mayada ya da kültür kabında besin çekilince otofajinin artması, bir insanda bir yeme düzeninin ya da bir maddenin otofajiyi artırdığını ya da bunun sağlığa yararlı olduğunu göstermez.

Cuma akşamüstü

Utku üç kabın satırlarını defterine alt alta yazıyor: "6", "18", "1,5". Yanına bir kese çiziyor, iki zarını ayrı kalemle: "19 milyon lipit, 0,52 µm³".

Firuze Hanım baskıyı yeniden büyütüyor; kesedeki mitokondri parçasının kenarı dağınık. "Bu rastgele alınmış bir sitoplazma parçası olabilir," diyor. "Ya da bozulmuş bir mitokondri özellikle toplanıp içeri çekildi. Yeni yılda o ikisini ayırmayı deneriz."

Kendini sına

1. Engelleyicisiz 10, iki saatlik engelleyiciyle 16 nokta sayılan bir kapta akış saatte kaç noktadır? Bu kap olağan kaptan hızlı mı?
2. Yarım mikrometre çaplı bir otofagozomun çift zarı için kaç lipit gerekir? Hacmi bir mikrometrelik kesenin kaçta biridir?
3. Syntaxin 17 neden açık fagoforda bulunmaz ve bu yerleşimin lizozom açısından sonucu ne olur?
4. İki renkli LC3 düzeneğinde lizozom pompası durdurulursa noktaların rengi nasıl değişir?
5. p62 hem ubikitine hem LC3-II'ye bağlanamasaydı, yığın otofajiyle seçici otofajiden hangisi aksardı?

Bir sonraki derse köprü

Mitofaji dersi bu seçiciliği tek bir organelde soracak. Zar potansiyelini yitirmiş bir mitokondri hücreye nasıl belli olur; PINK1 onun dış zarında neden birikir ve Parkin'i neden çağırır? Kurulan ubikitin zinciri hangi alıcılarca okunur ve bu seçici yol, sitoplazmayı ne gelirse alan yığın otofajiden hangi adımda farklılaşır?