Endozomal Sistem

Ekranda ayrılan iki renk

Aralığın son pazartesisi, Gümüşhane. Bir üniversitenin canlı hücre görüntüleme laboratuvarında odanın tek ışığı, ısıtmalı tablası 37 derecede tutulan mikroskobun ekranı. Firuze Hanım yıllardır hücrenin içindeki kesecik trafiğini canlı izliyor. Utku bu dönem laboratuvara katıldı ve ilk ayını zaman atlamalı çekimin ayarlarını öğrenerek geçirdi.

Kaptaki hücrelere aynı anda iki yük verilmiş: kırmızı işaretli transferrin ve yeşil işaretli epidermal büyüme faktörü, kısaca EGF. Beşinci dakikanın karesinde iki renk üst üste, zarın hemen altında sarımsı noktalar hâlinde. Otuzuncu dakikada ayrılmaya başlıyorlar. Birinci saatte kırmızı iki yerde duruyor: hücrenin kenarında ince bir çizgi ve çekirdeğin yanında gevşek bir bulut. Yeşil çekirdeğe yakın, iri ve yuvarlak noktalarda toplanmış. İkinci saatte kırmızının ışığı hiç azalmamış; yeşilinki başlangıcın üçte birine inmiş.

Yan kapta aynı iki yük var, ama bu hücrelerde ESCRT denen makinenin bir parçası susturulmuş. Kırmızı burada da aynı yerlere dağılıyor. Yeşil ise sönmüyor: iki saat sonra ışığının çoğu, halka gibi şişmiş keseciklerin kenarında takılı duruyor.

"Aynı kapıdan girdiler," diyor Utku. "Biri geri çıkıyor, öteki eriyor." Firuze Hanım yan kabı gösteriyor. "Eriyen de kendiliğinden erimiyor. Onu bir yere çeken var; çeken susunca yeşil kapıda bekliyor."

Bu derste ne olacak

Renklerin ayrıldığı bölmeyi bir kavşak olarak ele alacak ve bir zarın yükü yalnız biçimiyle nasıl ayırabildiğini hesaplayacağız. Ardından dönüşün yollarını, yıkıma gidecek alıcıyı seçen işareti ve endozom zarını ters yönde tomurcuklandıran makineyi izleyeceğiz. En sonda yolun iki çıkışına varacağız: lizozom ve hücrenin dışı.

Metin

Kavşağın biçimi

Endositoz dersinde (L03-P01-M03-D07) floresanlı transferrinin yirmi dakikada çekirdeğin yanında bir kümeye toplandığını, erken endozomun hafif asitli olduğunu ve yükün orada bırakıldığını görmüştük. Erken endozomun kimliğini Rab5'in, geç endozomunkini Rab7'nin taşıdığını ise Veziküler Trafik dersinde izlemiştik. Açık kalan soru, o asitli bölmede alıcıyla yükün yollarının nasıl ayrıldığıydı.

Wikipedia'nın endozom maddesi erken endozomu borucuklarla birbirine bağlı keselerden kurulu bir ağ olarak tarif eder: keseler bir mikrometreye kadar büyüyebilir, borucukların çapı 50 nanometre dolayındadır. Mayor, Presley ve Maxfield'in 1993 Journal of Cell Biology makalesi de bu bölmeyi 250–500 nanometrelik küresel gövdelere bağlı, 50–60 nanometrelik dar borucuklar olarak aktarır. Bu karışık biçim bir ayırma aracıdır.

Kurgu bir endozomla bakalım: gövdesi 400, borucuğu 50 nanometre çaplı olsun. Bir kürede yüzeyin hacme oranı 3/r'dir; 200 nanometrelik yarıçapta 3 ÷ 200 = 0,015 nm⁻¹ eder. Uçlarını saymadığımız bir silindirde oran 2/r'dir; 25 nanometrelik yarıçapta 2 ÷ 25 = 0,08 nm⁻¹. Borucuk, taşıdığı sıvıya göre gövdeden 0,08 ÷ 0,015 ≈ 5,3 kat fazla zar taşır.

Bir mikrometre boyundaki tek bir borucuğun yüzeyi 2 × π × 25 × 1000 ≈ 157.000 nm², gövdeninki 4 × π × 200² ≈ 503.000 nm²'dir. Borucuk koparsa endozomun zarının 157.000 ÷ 660.000 ≈ 0,24'ünü, yani dörtte birine yakınını götürür. Hacimde borucuk yaklaşık 2,0, gövde 33,5 milyon nm³ tutar; borucuğun payı 2,0 ÷ 35,5 ≈ 0,055'tir, yirmide birin biraz üstü. Zara gömülü alıcılar borucuğa kolayca girer, lümende yüzen serbest yük gövdede kalır. Borucuklar birkaç tur kurulup koptukça gövdede zar azalır, sıvı olduğu gibi durur.

Mayor ekibi bu fikri sınadı. Yalnız zara gömülen ve hiçbir ayırma işareti taşımayan floresan bir lipit, transferrinle aynı yolu aynı hızla izledi. Grant ile Donaldson'ın 2009'da yayımlanan geri dönüşüm derlemesi, geometriye dayanan bu yinelemeli ayırmayı bugün yaygın kabul gören model olarak anar.

Dönüşün iki hızı, bir de üçüncü adres

Wikipedia'nın maddesine göre bazı moleküller erken endozomdan doğrudan zara döner, çoğu ise önce geri dönüşüm endozomlarına uğrar; demirini bırakmış transferrin iki yolu da kullanır. Grant ile Donaldson aynı ayrımı hızlı ve yavaş yol diye adlandırır. Hızlı yol için Rab4 ile Rab35'i anarlar, ama Rab4'ün rolünü belirsiz bulurlar: baskın-negatif bir Rab4 hızlı dönüşü engellerken, Rab4'ü azaltmak onu artırmıştır. Baskın-negatif etkiyi ER Stresi ve Hastalık dersinde tanımlamıştık; burada bir işlevin haritasını çıkarmak için kullanılan araçtır.

Yavaş yolun bu durağını iki kaynak da aynı biçimde yerleştirir: mikrotübüllerin çıktığı merkezin çevresinde, çekirdeğin hemen yanında. Utku'nun ekranındaki kırmızı bulut orasıdır; kenardaki ince çizgi, yüzeye yeniden varmış transferrindir.

Üçüncü adres Golgi'dir. Veziküler Trafik dersinde mannoz-6-fosfat alıcısının lizozom enzimlerini endozomda bırakıp Golgi'ye döndüğünü söylemiş, dönüşü taşıyan aracı adlandırmamıştık. Wikipedia'nın endozom ve retromer maddeleri ile Huotari ve Helenius'un 2011 EMBO Journal derlemesi bu aracı retromer diye anar. Retromerin üç proteinli çekirdeği alıcıyı tanır. Wikipedia'nın maddesine göre yanındaki sıralama neksinleri zarı borucuk biçiminde kıvırır. Kopan borucuk alıcıyı trans-Golgi ağına geri taşır.

Yıkıma ayrılan alıcı

EGF alıcısı başka bir kader izler. Goh ile Sorkin'in 2013 derlemesine ve Wikipedia'daki endozom maddesine göre alıcı EGF'yi bağlayınca kendi kinazını çalıştırır ve sitozole bakan kuyruğuna ubikitin takılmasına yol açar. Protein Katlanması dersinde ER'de takılı kalan zincirlerin aynı küçük proteinle işaretlendiğini görmüştük. Etiketin kimyası ve proteazom, Ubiquitin–Proteazom Sistemi dersinde ayrıca açılacak. Endozomda bu etiketi okuyan, bambaşka bir makinedir.

Wikipedia'nın ESCRT maddesi ile Hurley'nin 2015 EMBO Journal derlemesi iş bölümünü benzer biçimde anlatır. ESCRT-0 hem endozom zarına özgü bir fosfoinozitid lipidine hem ubikitine tutunur. Hurley'e göre ubikitinli yükü düz, klatrinle kaplı bir alanda toplar; Huotari ile Helenius da erken endozomun sitozol yüzündeki bu klatrinli, ESCRT'li plakaları betimler. ESCRT-I ile ESCRT-II yükü devralıp zarı bükmeye başlar. ESCRT-III tomurcuğun boynunda halkalar ve sarmallar kurar. Henne, Stenmark ve Emr'in 2013 derlemesi bu polimerin dinamik olduğunu ve boynun kesilmesine Vps4'ün katkıda bulunduğunu yazar.

Önemli olan yön. ESCRT maddesi tomurcuğun sitoplazmadan uzağa büyüdüğünü, Hurley de bu makinenin boynu içeriden kestiğini yazar. Endositoz dersinde kesecik sitoplazmaya doğru kopuyor, dinamin boynu dışarıdan sıkıyordu. Burada kesecik endozomun lümenine düşer ve alıcının kinazlı kuyruğu, ubikitiniyle birlikte bu küçük keseciğin içine kapanır. Wikipedia ile Huotari ve Helenius aynı sonuca varır: alıcının sinyal veren ucu sitozolla bağını yitirir, uyarı kesilir.

Huotari ile Helenius geç endozomun çapını 250–1000 nanometre verir; lümeninde çoğu kez otuz ya da daha fazla, 50–100 nanometrelik kesecik bulunur. Kurgu bir geç endozomu 500, keseciklerini 50 nanometre alalım. Sınırlayıcı zarın yüzeyi 4 × π × 250² ≈ 785.000 nm²'dir. Endositoz dersinde 100 nanometrelik keseciğe düşen zarı bulmuştuk; yarı çaplı bir kesecik bunun dörtte birini, 7.850 nm² kadarını ister. Her lümen içi kesecik sınırlayıcı zarın yüzde birini, otuz tanesi yüzde otuzunu yer. Aynı otuz kesecik hacmin ancak 30 × 25³ ÷ 250³ = 0,03'ünü doldurur. Endozom yine de erimez, çünkü aynı derleme geç endozomların birbiriyle kaynaşarak büyüdüğünü yazar.

Yan kaptaki takılı yeşil, bu adımın eksikliğidir. Bishop, Horman ve Woodman 2002'de ESCRT-I'in bir bileşeni olan TSG101 azaltıldığında EGF'nin yolunun bozulduğunu ve ubikitinin endozom bölmelerinde toplandığını bildirdi. Razi ile Futter'in 2006 çalışmasında TSG101'in azaltılması EGF yıkımını güçlü biçimde engelledi ve çok veziküllü cisim kurulamadı. ESCRT-0'ın bileşeni Hrs azaltıldığında ise yıkım yalnız hafifçe geriledi.

Varış noktası ve öteki çıkış

Geç endozomun yolculuğu lizozomla kaynaşarak biter. Wikipedia'nın maddesi bu kaynaşmanın, yoğunluğu da özellikleri de iki organelin arasında kalan hibrit bir bölme verdiğini, lizozomun sonra yeniden yoğunlaştığını yazar. Huotari ile Helenius bu geçici hibride endolizozom der ve yıkımın çoğunun burada yürüdüğünü ekler. Aynı derlemeye göre sınırlayıcı zar yoğun şekerli proteinlerden bir örtüyle korunur, lümen içi keseciklerde ise bu örtü yoktur; alıcılar bu yüzden sindirime açık hâlde varır.

Her çok veziküllü cisim lizozoma gitmez. Wikipedia, Huotari ile Helenius ve Kalluri ile LeBleu'nun 2020 Science derlemesi bu cismin bazen plazma zarıyla kaynaştığını ve lümen içi keseciklerini hücre dışına saldığını yazar.

Kalluri ile LeBleu ve Wikipedia'nın ekzozom maddesi bu keseciklerin ilk kez olgunlaşan genç alyuvarlarda tanındığını aktarır: hücre artık gerekmeyen transferrin alıcılarından bu yolla kurtuluyordu. Kültür hücresinde geri dönen alıcı, olgunlaşan alyuvarda dışarı atılır. Kalluri ile LeBleu hücre dışı keseciklerin tek tek saptanmasının ve saf olarak ayrılmasının hâlâ sınırlı olduğunu vurgular. Kozmetik ya da tedavi amacıyla satılan ekzozom ürünleri bu hücre içi yoldan bir dayanak alamaz. Endozom trafiğindeki aksamaların bazı kalıtsal ve sinir sistemi hastalıklarıyla ilişkisi araştırılıyor, ama bu araştırmalardan kişiye dönük bir karar çıkarılamaz.

Soluyan yeşil

Utku son iki kareyi ekranın iki yarısına yerleştiriyor. Defterine bir kavşak çiziyor: ortada yuvarlak bir gövde, ondan uzanan ince kollar. Kolların ucuna "kırmızı, Rab11", gövdenin içine küçük daireler ve yanına "yeşil, ESCRT" yazıyor. Borucuğun kenarına "5,3 kat zar", dairelerin yanına "30 kesecik, zarın %30'u" notlarını düşüyor.

Firuze Hanım kalemi alıp yeşilin söndüğü noktaları daire içine alıyor. "Söndü diyoruz. Işığı söndüren ne? Endozom lizozoma varınca içerisi birdenbire başka bir ortama dönüşüyor." Dolaptan, asitte rengini değiştiren bir boyanın şişesini çıkarıp tezgâhın kenarına bırakıyor. "Çarşamba bununla bakarız."

Kendini sına

1. Borucuğun çapı 60, gövdenin çapı 500 nanometre olsaydı borucuğun yüzey–hacim oranı gövdeninkinin kaç katı olurdu?
2. Lümen içi keseciklerin çapı 80 nanometre olsaydı, 500 nanometrelik bir geç endozomda otuz kesecik sınırlayıcı zarın yaklaşık yüzde kaçını tüketirdi?
3. ESCRT'nin tomurcuğu sitoplazmaya değil lümene doğru büyütmesi, EGF alıcısının sinyali açısından neden belirleyicidir?
4. Retromer çalışmasaydı mannoz-6-fosfat alıcısına ne olurdu ve trans-Golgi ağında yeni lizozom enzimlerinin ayrılması bundan nasıl etkilenirdi?
5. Yan kapta yeşil neden sönmeyip şişmiş halkalarda kaldı? Kırmızının dağılımı neden değişmedi?

Bir sonraki derse köprü

Lizozomal Asidifikasyon dersi hibrit organelin içini soracak. Lizozom zarındaki V-ATPaz her protonu içeri taşırken zarda bir elektrik yükü de biriktirir; klorür gibi bir karşı iyon geçmezse bu yük pompayı nasıl durdurur? Asit hidrolazlar pH 4,5–5'te çalışırken lizozomun kendi zarını, LAMP adlı glikozillenmiş zar proteinleri nasıl korur?