Protein Modifikasyonu ve Sınıflandırma

Pazartesi, üç kap

Aralığın üçüncü haftası pazartesi sabahıyla açılıyor. Ediz cuma akşamı kurduğu üç deneyin sonuçlarını masaya dizmiş.

Birincisi bir jel. Kültürdeki hücrelere salgıladıkları bir glikoproteini on dakika işaretli amino asitle yaptırmış, sonra işaretsiz ortamda bekletip 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda örnek almış. Her örneği ikiye bölmüş, yarısına Endo H adlı bir şeker kesen enzim eklemiş. Enzimli şeritlerde bant iki kata ayrılıyor: aşağı kayan kesilmiş, yerinde kalan kesilmemiş. Ediz yerinde kalanın payını yazmış: yüzde 23, 54, 75 ve 87.

İkincisi pankreas adacıklarından alınmış hücrelerin kabı. İnsüline bağlanan bir antikorla boyanmış jelde ilk örnekte tek, iri bir bant var; bir saat sonra onun yanında daha küçük iki bant belirmiş. Üçüncüsü, dibi gözenekli bir kap ekinde büyütülmüş epitel tabakası. Aynı salgı proteininin iki biçimi eklenmiş: şeker dalı taşıyan biçim üst bölmede toplanmış, dalı alınmış biçim iki bölmeye kabaca eşit dağılmış.

"Cuma sorduğunuz ayrımın cevabı bu üç kabın içinde," diyor Ediz. "Ama sanırım üç ayrı cevap."

Bu derste ne olacak

Önce şeker dalının Golgi'de geçirdiği dönüşümü Endo H jeli üzerinden okuyacağız. Ardından serin ve treonine eklenen şekerlere, zinciri kesen enzimlere ve son olarak trans-Golgi ağında yükün hangi kapıdan çıkacağını belirleyen ölçütlere geçeceğiz.

Mekanizma

Kırpılan dal, yeniden örülen dal

ER'de proteine topluca aktarılan dalın glukozlarının kırpıldığını ve dalın, kalneksin döngüsünde bir denetim etiketi gibi okunduğunu görmüştük. Golgi'ye ulaşan dal mannozdan zengindir. Golgi'deki şeker işlemesini toplayan 2011 derlemesinde Stanley, cis-Golgi mannozidazlarının bu dalı beş mannozlu bir ara ürüne indirdiğini yazar. Medial Golgi'deki N-asetilglukozamin transferaz I bu ara ürüne ilk N-asetilglukozamini takar. Stanley bu adımı hibrit ve kompleks dalların ortak başlangıcı sayar.

Transferaz I'in ardından mannozidaz II iki mannozu daha söker, ikinci bir transferaz öbür kola N-asetilglukozamin ekler. Trans tarafında kollara galaktoz, uçlarına siyalik asit eklenir. Stanley bu dalın altı kola kadar çatallanabileceğini yazar.

Ediz'in jeli bu yolun saatini okur. Wikipedia'nın Endo H maddesine göre enzim, mannozidaz II iki mannozu sökene dek dalın her biçimini keser, sonrasına dokunamaz. Stanley de kompleks dalların Endo H'ye dirençli, hibritlerin duyarlı kaldığını yazar. Kesilmeyen bant, medial Golgi'ye varışın izidir.

Veziküler Trafik dersinde her basamağı dakikada yüzde üçle aşan kurgu bir yük kurmuştuk. Direnç tek bir basamağa bağlı olsaydı pay 1 − e^(−0,03 × 30) ≈ 0,59'la başlardı. Oysa ER'den çıkış ve medial Golgi'ye varış arka arkaya dizilince pay 1 − e^(−0,9) × (1 + 0,9) ≈ 0,23 olur; 60, 90 ve 120. dakikalar için aynı formül 0,54, 0,75 ve 0,87 verir. Eğrinin başındaki gecikme, yükün önce bir bekleme odasından geçtiğini gösterir.

Kalıpsız bir üretim

Protein zincirini ribozom bir mesajı kopyalayarak kurar; şeker dalının böyle bir kalıbı yoktur. Vliegenthart'ın 2017 derlemesi glikan eklenmesini kalıba dayanmayan, art arda çalışan transferazlar ve glikozidazlarla yürüyen bir süreç olarak tanımlar. Robinson ve arkadaşlarının 2012 derlemesi düzeltme adımı olmadığını, enzimlerin dokuya ve gelişim evresine göre değiştiğini ekler. Dalın biçimini gen doğrudan yazmaz; yığında hangi enzimin, hangi sırayla ve ne kadar süre bulunduğu belirler.

Stanley bunun sonucunu açıkça yazar: Golgi'deki yapım dinamik ve rekabetçi olduğundan, olgun bir glikoproteinin dalları tek bir bağlanma yerinde bile türdeş değildir.

Küçük bir hesap bu karışımın nasıl doğduğunu gösteriyor. İki kollu bir kompleks dalda her kolun ucuna siyalik asit eklenme olasılığı kurgu olarak 0,8 olsun. İki kolun da tamamlanma olasılığı 0,8 × 0,8 = 0,64, yalnız birinin 2 × 0,8 × 0,2 = 0,32, hiçbirinin 0,2 × 0,2 = 0,04 çıkar. Tek bağlanma yerinde bile üç ürün çıkıyor. Enzim azaldığında ya da yük yığında kısa kaldığında olasılık 0,6'ya iner ve iki kolu dolu dalın payı 0,36'ya düşer.

Serin ve treonine eklenen şeker

Glikokaliks dersinde O-bağlı dalın ilk şekeri olan N-asetilgalaktozaminin katlanmış zincire Golgi'de takıldığını görmüştük. Bennett ve arkadaşlarının 2012 sınıflandırması bu işi yirmiye kadar benzer genin kodladığı bir enzim ailesine verir; Wikipedia da aynı ailenin yirmi üyesini sayar. N-bağlı dalın aksine burada kısa ve kesin bir tanıma dizisi yoktur. Bennett ekibi, enzimlerin hangi serini ya da treonini seçeceğini öngören genel bir motifin henüz bulunamadığını yazar. Stanley de bu yöndeki ölçütlerin daha yeni belirmeye başladığını söyler. ER'deki gibi hazır bir blok aktarılmaz; şekerler zincire tek tek eklenir.

Kollajen ve proteoglikanlar dersinde kıkırdağın şişe fırçasına benzeyen molekülünü görmüştük. Stanley'ye göre o fırçanın uzun şeker zincirleri Golgi'de bir serine takılan ksilozla başlar ve Golgi'nin sülfotransferazları zincirleri sülfatlar. Wikipedia'ya göre Golgi'den geçen salgı proteinlerinin bir kısmının tirozinlerine de sülfat eklenir.

Kesilerek olgunlaşan zincir

Adacık kabındaki iri bant proinsülindir. Philipson, Bell ve Polonsky'nin 2015 anma yazısı ile Wikipedia, Donald Steiner'in 1967'de insülinin tek bir zincir olarak yapıldığını bulup ona proinsülin adını verdiğini yazar. Anma yazısına göre bu, bir öncülün özelleşmiş proteazlarca olgun hormona işlendiğinin ilk açık gösterimiydi.

Thomas ailenin üyelerini oturdukları bölmeye göre ayırır. Furin trans-Golgi ağında ve endozomlarda çalışır; Wikipedia onun kanonik kesim yerini arginin, herhangi bir kalıntı, lizin ya da arginin ve yine arginin diye verir. PC1/3 ile PC2 ise nöroendokrin hücrelerin salgı granüllerinde oturur ve Wikipedia'ya göre eşli bazik kalıntıların arkasından keser.

Proinsülin iki böyle çift taşır. UniProt kaydına göre insanda zincir 86 kalıntıdır: 30 kalıntılık B zinciri, iki arginin, 31 kalıntılık C-peptit, bir lizin ile bir arginin ve 21 kalıntılık A zinciri. Weiss'ın 2009 derlemesi A ve B zincirlerinin boyunu aynı verir. Toplam 30 + 2 + 31 + 2 + 21 = 86 eder. Olgun insülin 30 + 21 = 51 kalıntıdır; kesimle 86 − 51 = 35 kalıntı ayrılır, bunun 31'i C-peptit, 4'ü bazik çiftlerdir. Wikipedia'nın proinsülin maddesi aynı dökümü verir.

Ediz'in jelinde iki küçük bandın bir saat sonra belirmesi, kesimin yolun sonunda yapıldığını gösterir.

Trans ucundaki kapılar

Ekzositoz dersinde yapısal salgının her hücrede durmadan işlediğini, düzenlenmiş salgının ise bir uyarı ve kalsiyum beklediğini ayırmıştık. Bu ayrımı trans-Golgi ağı yapar. Dikeakos ile Reudelhuber'e göre bütün hücreler yapısal yolla salgılar. Granüle gidecek proteinler ise onları bu yoldan ayıran bir ayrım bilgisi taşır; özel bir sinyal taşımayan yük yapısal yoldan çıkar.

Granül yükünü ayırmak için önerilen düzeneklerden biri kümelenmedir.

Courel ve arkadaşlarının 2010 çalışması kromogranin ve sekretograninleri bu granüllerin başlıca çözünür bileşenleri olarak sayar; bu proteinler trans-Golgi ağındaki koşullarda kümelenir ve sekretogranin II'nin granül kurması asitliğe bağlıdır. Dikeakos ile Reudelhuber de graninlerin hafif asidik ortamda kümelendiğini aktarır. Olgunlaşan granülde yapısal yük düşük yoğunluklu keseciklerle dışarı atılır. Palade'nin pankreasta izlediği yoğunlaşan kofullar bu olgunlaşmamış granüllerdir.

Aynı derleme ikinci bir ölçütü de gösterir. Bazı öncüllerde bazik çift, granül konvertazının yeri olduğu sürece granüle gitmeyi kolaylaştırır. O yer furinin tanıdığı bir diziye çevrildiğinde protein yapısal yoldan dışarı çıkmıştır. Lizozom enzimlerinin mannoz-6-fosfat işaretiyle bu ağdan ayrı bir kapıya gittiğini Veziküler Trafik dersinde okumuştuk.

Üçüncü kap başka bir ayrımı gösteriyor. Sıkı bağlantılar dersinde kap ekindeki epitelin üst ve alt bölmeyi ayırdığını, bağlantının iki yüzün proteinlerini karıştırmayan bir çit olduğunu görmüştük. Stoops ile Caplan'ın 2014 derlemesine göre taban-yan yüzüne gidecek zar proteinleri sitozol kuyruklarında tirozin temelli ya da iki lösinli kısa diziler taşır; tirozin sinyallerini epitele özgü AP-1B adaptörü okur. Fölsch'ün 2008 derlemesi tepe yüzün bilgisinin çoğunlukla lümendeki kısımda, N- ya da O-bağlı dallarda ve GPI çapasında bulunduğunu yazar. Lipit Salları dersinde bu çapalı proteinlerin tepe yüze ayıklandığı fikriyle tanışmıştık. Stoops ile Caplan'a göre dalsız bir salgı proteinine N-bağlı dal eklenince protein tepe yüzden salgılanmıştır. Dalı alınmış biçim ise tercihini yitirmiş.

Glikozilasyonun kalıtsal olarak aksadığı bazı nadir durumlar bilinir; onlar bu mekanizma anlatısının konusu değildir.

Modelin sınırı

• Endo H direnci tek yönlü bir işarettir. Stanley'nin uyardığı gibi duyarlılık, yükün ER'de kaldığını kanıtlamaz; hibrit dal Golgi'yi geçse de kesilir.
• Kurgu eğri her basamağı sabit bir hızla ve iki basamakla modelledi. Gerçek taşıma ER çıkış noktalarında bekleme, geri dönüş ve olgunlaşan sisternalar içerir.
• Dikeakos ile Reudelhuber'e göre granüle ayrımın yeri ve düzeneği tartışmalıdır: kümelenme, zar bağları ve olgunlaşma sırasında ayıklanma birlikte işleyebilir; insülin gibi bazı yükler birden çok yolu kullanır.
• Stoops ile Caplan'a göre GPI çapasının tepe yüze ayıklama için tek başına yetip yetmediği tartışmalıdır. Kap ekindeki köpek böbreği hücreleri gibi modeller her epiteli temsil etmez.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Şeker dallarının Golgi'de kurulması, "glikozilasyonu düzelttiği", "şeker kodunu onardığı" ya da hücrelere eksik şekerleri sağladığı söylenen hiçbir şeker karışımına ya da takviyeye dayanak olamaz. Dalın biçimini besinle gelen şeker değil, hücrenin enzim takımı belirler.
• İnsülin ve C-peptit burada yalnız bir öncülün nasıl kesildiğinin örneğidir; bu anlatıdan kan şekeri ya da hormon ölçümüne ilişkin bir sonuç çıkmaz.

Üç cevap

Ediz defterin boş bir sayfasını üçe bölüyor. Birincisinin başına "Endo H: 0,23 → 0,87 · iki basamak", ikincisine "86 = 30 + 2 + 31 + 2 + 21 · kesim granülde", üçüncüsüne "şeker dalı → üst bölme · dal yok → iki yana" yazıyor. En alta "Kalıp yok; enzim, sıra, süre" ekliyor.

Suzan Hanım adacık kabının jelini alıyor. "Bu hücre bir saatte bu kadarını kesip paketliyor," diyor. "Peki ER'si katlayabileceğinden çok proinsülin alırsa? Hücre yükü bu hızla taşımak zorunda kalırsa neyi feda eder?"

Kendini sına

1. Siyalik asit eklenme olasılığı her kolda 0,5 olsaydı iki kollu dalın üç glikoformunun payları ne olurdu?
2. Her basamak dakikada yüzde iki hızla aşılsaydı 60. dakikada Endo H'ye dirençli pay iki basamaklı modelde ve tek basamaklı modelde kaç olurdu?
3. Bir glikoprotein bütün örneklerde Endo H'ye duyarlı kalıyorsa bu, proteinin Golgi'ye hiç ulaşmadığını kanıtlar mı? Neden?
4. Bir öncülün granül konvertazına ait kesim yeri furinin tanıdığı diziye çevrilirse kesim nerede yapılır ve protein hangi yoldan çıkar?
5. Epitel hücresinde tirozin temelli kuyruk sinyali okunamazsa taban-yan yüzde durması gereken bir zar proteini nereye gidebilir?

Bir sonraki derse köprü

ER Stresi ve Hastalık dersi modülün vaka dersi olacak. Salgı yükü çok büyük bir hücrede gelen zincir sayısı ER'nin katlama kapasitesini aşınca, katlanmamış protein yanıtında gördüğümüz uyumdan ölüme geçiş bir dokuda nasıl okunur? Bu geçişe dair bulguların hangisi hücre kültüründen, hangisi hayvan modelinden, hangisi insandan gelir ve bu düzeyler birbirinin yerine konabilir mi?