Katlanmamış Protein Yanıtı

Çarşamba, dört panel

Çarşamba sabahı ışıklı kutu kapalı; Suzan Hanım'ın masasında dört çıktı sıralanmış, her birinin altında aynı saat çizgisi: 0, 1, 2, 4, 8, 16 ve 24. Ediz pazartesi öğleden sonra salgı hücrelerinin kaplarına, pazartesi jelinin ikinci kabındaki indirgeyiciyi bu kez yarım dozda koymuş ve bir gün boyunca belli saatlerde kap toplamış.

Birinci çıktı, her kaba kısa süre verilen işaretli amino asidin proteine ne kadar girdiğini gösteriyor. Eğri birinci saatte olağanın üçte birine düşmüş, sekizinci saatten sonra yarı yoluna kadar geri tırmanmış. İkinci çıktı bir jel: XBP1 adlı bir mesajın parçası çoğaltılmış. Sıfırıncı saatte tek bant var; birinci saatte hemen altında ikinci, biraz daha kısa bir bant belirmiş ve dördüncü saatte üstteki bandı geçmiş. Yirmi dördüncü saatte alttaki bant yeniden solmuş. Üçüncü çıktıda BiP bandı ilk iki saat yerinde sayıyor, dördüncü saatten sonra kalınlaşıyor. Dördüncü çıktı ölen hücrelerin payını gösteriyor: sekizinci saate kadar zemindeki gürültüden ayırt edilmiyor, on altıncı saatte yükselmeye başlıyor.

"Pazartesi sorduğunuz şey," diyor Ediz, "hücrenin fark edip etmediğiydi. Fark ediyor. Hem de bir saat içinde."

Bu derste ne olacak

Önce algılayıcıların yükü nasıl fark ettiğine bakacağız. Sonra dört paneli kollara dağıtıp her kolun ne işe yaradığını okuyacağız ve dersi, uyumun ölüme döndüğü noktanın ne kadar az bilindiğiyle kapatacağız.

Mekanizma

Zardaki nöbetçiler

Wikipedia'nın UPR maddesi ile Hetz, Zhang ve Kaufman'ın 2020 derlemesi memeli hücrelerinde bu ağın üç kolunu sayar. Her kolun başında ER zarını geçen bir protein durur: IRE1, PERK ve ATF6. Üçünün de lümene bakan bir ucu, sitozola bakan başka bir ucu vardır. Hücre zarı modülünün son mekanizma dersinde bir alıcının dış yüzde uyarıyı yakalayıp iç yüzde işi başlattığını görmüştük; bu kez dış yüz hücrenin dışı değil, ER'nin içidir.

Algılayıcılar yükü nasıl duyar? En eski açıklamada ipucu, pazartesi tanıdığımız BiP'tir. Bertolotti ile arkadaşları 2000'de stressiz hücrelerde BiP'in PERK ile IRE1'in lümen uçlarına sıkıca bağlı olduğunu, katlanma bozulunca bu bağın geri dönüşlü biçimde çözüldüğünü ve BiP fazla yapıldığında algılayıcıların geç uyandığını gösterdiler. Wikipedia maddesi de aynı rekabet modelini anlatır: katlanmamış zincirler çoğaldıkça BiP onların yağ seven yüzeylerine çekilir, algılayıcıları serbest bırakır ve serbest kalan algılayıcılar ikili, sonra daha büyük kümeler kurar. Nöbetçiyi uyandıran, BiP'in başka işe çağrılmasıdır.

IRE1: RNA kesen kinaz

Credle ile arkadaşlarının 2005 özeti IRE1'i iki işli bir enzim olarak tanımlar: sitozol ucunda hem bir kinaz hem bir RNaz vardır. Kümelenen IRE1 molekülleri birbirini fosforlar; integrin sinyali dersinde odak yapışma kinazının kendi tirozinine fosfat taktığını görmüştük, burada da işaret kendi kendine başlar. Hetz ekibine göre fosforlanma RNaz cebini açar ve enzim artık bir mesajı kesebilir.

Kestiği mesaj XBP1'dir. Hetz ekibi ile Lee ve arkadaşlarının 2002 özeti, IRE1'in XBP1 mesajının ortasından 26 nükleotitlik küçük bir parça çıkardığını yazar. Ediz'in jelindeki alt bant bu kısalmış mesajdır.

Parça çıkınca neden bambaşka bir protein doğar? Ribozom mesajı üçer harflik kodonlar hâlinde okur. 26 ÷ 3 = 8, kalan 2: silinen parça sekiz tam kodon ve iki artık harftir. Kesim noktasından sonra ribozom her üçlüyü bir harf kaymış olarak okur, yani okuma çerçevesi kayar. Hetz ekibi bu kaymayı açıkça yazar; Lee ekibi de eklemenin proteine yeni bir C ucu kazandırdığını söyler. Çıkan parça 27 nükleotit olsaydı 27 ÷ 3 = 9, kalan 0 olurdu; dokuz amino asit eksilir ama arkadaki dizi değişmezdi.

Yoshida ile arkadaşları 2001'de bu kesimi alışılmadık bir ekleme diye adlandırdı. Uemura ve arkadaşları 2009'da olağan eklemenin yalnız çekirdekte yapıldığını, XBP1'inkinin ise çoğunlukla sitoplazmada, kesilen iki ucu birleştiren bir RNA ligazıyla tamamlandığını gösterdiler. Çekirdekteki olağan eklemeyi gen ifadesinin işlendiği derslerde göreceğiz; buradaki, ER zarında gerçekleşen bir istisnadır. IRE1'in bir işi daha vardır: Hollien ile arkadaşlarına ve Hetz ekibine göre zar ve salgı proteinlerinin bazı mesajlarını da keserek yıkar; bu kısım düzenlenmiş IRE1 bağımlı yıkım (RIDD) diye anılır ve yükü ne kadar azalttığı henüz belirlenmemiştir.

XBP1s çekirdekte neyi açar? Lee ile arkadaşlarının 2005 özeti ER şaperonlarının genlerini ve ER'nin büyümesini sayar. Yoshida ekibinin 2003 özeti yıkım yolunu hızlandıran bir mannozidaz benzeri proteinin XBP1'e bağlı açıldığını gösterir; pazartesi ERAD'a götüren mannoz saatini okumuştuk. Sriburi ile arkadaşları 2004'te XBP1s'in tek başına fosfatidilkolin yapımını artırdığını ve granüllü ER yüzeyini genişlettiğini buldu. Fosfolipitleri işlediğimiz derste lesitin diye tanıdığımız bu molekül, ER zarının başlıca yapı taşıdır.

PERK: girişi kısmak

Birinci paneldeki hızlı düşüş PERK'in işidir. Wikipedia maddesine göre PERK de kümelenip kendini fosforlar, sonra çeviriyi başlatan eIF2 adlı yardımcının α alt birimine fosfat takar. Harding ile arkadaşlarının 2000 özeti ve Hetz ekibi sonucu aynı biçimde yazar: mesajların çoğunun çevirisi yavaşlar ve ER'ye giren zincir sayısı düşer.

Bu, ER'ye yeni iş gelmesini durdurmanın en hızlı yoludur. Kurgu birimlerle bir salgı hücresinin ER'sine dakikada 100 zincir girsin, bozulmuş kapasite ise dakikada 80 zinciri katlayıp yola çıkarabilsin. Her dakika 100 − 80 = 20 zincir birikir; yarım saatte 20 × 30 = 600 zincir lümende bekler. PERK çeviriyi yüzde otuz kısarsa giriş 70'e iner. Birikmiş yük artık dakikada 80 − 70 = 10 zincir eriyerek 600 ÷ 10 = 60 dakikada biter. Aynı hesap gösteriyor ki kısıntı kalıcı olamaz: girişi düşük tutmak salgıyı da düşürür. Kapasite şaperonlarla 100'e çıktığında çeviri tam hızına dönebilir.

Harding ekibi bu kolun işlevini tersinden gösterdi. PERK'i olmayan hücrelerde stres altında eIF2α fosforlanmadı, protein yapımı yüksek kaldı, ER stresi arttı ve hücreler daha kötü yaşadı. Protein yapımını başka bir maddeyle yavaşlatmak bu kaybı kısmen giderdi.

Kısıntının seçici bir yanı da vardır. Harding ekibinin aynı yıl yayımladığı ikinci özete göre çeviri genelde azalırken ATF4 adlı transkripsiyon faktörünün mesajı daha çok çevrilir. Hetz ekibi ve Wikipedia'nın ATF4 maddesi bunu mesajın başındaki kısa, önden okunan çerçevelere bağlar. ATF4 amino asit ve yükseltgenme dengesi genlerini açar; stres uzarsa CHOP adlı başka bir faktörü de. Hetz ekibi, ATF4'ün bir fosfatazı çağırarak eIF2α'daki fosfatı sonradan söktüğünü de yazar. Ediz'in eğrisinin sekizinci saatte geri tırmanması bu geri bildirimle uyumludur. eIF2α'yı fosforlayan başka kinazlar da vardır ve bu ortak düğüm entegre stres yanıtı dersinde işlenecek.

ATF6: Golgi'de kesilen haberci

Üçüncü kol bambaşka bir hileyle çalışır. Ye ile arkadaşlarının 2000 özetine göre ATF6 zara gömülü bir transkripsiyon faktörüdür ve stres altında kesilerek sitozol ucunu serbest bırakır. Kesimi yapan iki proteaz, S1P ve S2P, kolesterol azaldığında başka bir zar faktörünü kesen enzimlerin aynısıdır. Hetz ekibi ile Wikipedia maddesi yolun sırasını verir: ATF6 ER'den Golgi'ye taşınır, orada kesilir ve açığa çıkan parça çekirdeğe gidip şaperon genlerini açar. Hetz ekibine göre taşıma, kesecik trafiği dersinde tanıdığımız COPII kesecikleriyle olur.

Makasların ER'de değil Golgi'de beklemesi, kesimi ATF6'nın ER'den ayrılmasına bağlar. Ye ekibinin özetine göre S2P'si olmayan hücreler stres altında BiP yapımını artıramadı. Ediz'in üçüncü panelinde BiP bandının saatler sonra kalınlaşması bu gecikmeyi taşır: kesim, taşınma, gen açılması ve yeni proteinin birikmesi birbirine eklenir. Yoshida ve Lee ekiplerine göre ATF6 XBP1 mesajının miktarını da artırır; IRE1'in keseceği malzemeyi o hazırlar.

Uyumdan karara

Wikipedia maddesi yanıtın ilk hedeflerini çeviriyi durdurmak, yanlış katlananı yıkmak ve şaperon yapımını artırmak diye sıralar; bu hedeflere belli bir sürede ulaşılamazsa yanıt ölüme yönelir. Lin ile arkadaşları 2007'de süren streste IRE1 ile ATF6 etkinliğinin söndüğünü, PERK kolunun ise çeviri kısıntısı ve CHOP ile birlikte sürdüğünü gördüler. IRE1 yapay olarak etkin tutulduğunda hücreler daha iyi yaşadı. Ediz'in jelinde yirmi dördüncü saatte solan alt bant ile aynı saatlerde artan ölüm, bu sıralamayla örtüşüyor.

Lasker Vakfı 2014 Temel Tıp Araştırmaları Ödülü'nü Kazutoshi Mori ile Peter Walter'a, ER'deki yanlış katlanmış proteinleri algılayıp çekirdeğe düzeltici önlem sinyali gönderen bu kalite denetimi sistemine ilişkin buluşları için verdi; Wikipedia'daki maddeleri de ödülü aynı yıla koyar.

Modelin sınırı

• BiP'in algılayıcıdan ayrılması tek açıklama değildir. Credle ekibi IRE1'in lümen ucunda katlanmamış zinciri doğrudan tutabilecek bir oluk buldu; Wikipedia maddesi ve Hetz ekibi iki mekanizmanın birlikte çalışabileceğini yazar.
• Uyumun ölüme döndüğü eşik ölçülmüş değildir. Kolların sönme sırası bir ipucudur; anahtarın kendisi bilinmiyor.
• Deneylerin çoğu hücreye katlanmayı toptan bozan kimyasallar verilerek yapıldı. Hetz ekibi bu maddelerin fizyolojik olmadığını ve uyumla ölümü aynı anda tetiklediğini vurgular.
• Hetz ekibine göre bol ve kararlı bir protein olan BiP, anlık stresin iyi bir göstergesi değildir; kurgudaki zincir akışı ve kısıntı oranı da yalnız hesabın iskeletidir.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Üç kolun varlığı, "ER stresini azaltan", "UPR'yi dengeleyen" ya da "hücresel stresi temizleyen" diye sunulan hiçbir takviyeye, safra asidi ürününe, bitki özütüne, açlık ya da oruç protokolüne dayanak olamaz.

Çarşamba öğleden sonra

Ediz dört çıktının altına bir zaman şeridi çiziyor. Birinci saatin üstüne "PERK: giriş ↓" ve "IRE1: 26, çerçeve kayar", dördüncü saatin üstüne "ATF6 kesildi, BiP ↑" yazıyor; on altıncı saatin üstüne bir soru işareti koyup yanına "CHOP" ekliyor.

Suzan Hanım ATF6 okunun Golgi'ye uzanan kısmını parmağıyla izliyor. "Makaslar orada bekliyor," diyor. "Ama Golgi dediğimiz şey pankreas hücresinde tek bir kese değil. Onun nasıl dizildiğine bakmadan bu okun nereye vardığını tam bilemeyiz."

Kendini sına

1. IRE1 XBP1 mesajından 24 nükleotit kesseydi okuma çerçevesi ne olurdu? Ortaya etkin bir transkripsiyon faktörü çıkması beklenir miydi?
2. Kurgu hesapta PERK çeviriyi yüzde elli kıssaydı birikmiş 600 zincir kaç dakikada erirdi? Bu kısıntının salgı hücresine bedeli ne olurdu?
3. PERK'i olmayan hücrelerde protein yapımını yavaşlatmak neden sağkalımı kısmen düzeltir?
4. S2P'si olmayan bir hücrede stres altında BiP bandı nasıl görünürdü? Neden?
5. Ediz'in jelinde alt bandın yirmi dördüncü saatte solması hangi bulguyla örtüşür ve neden bu tek başına ölüm kararının nedeni sayılamaz?

Bir sonraki derse köprü

ATF6'nın makası Golgi'de bekliyordu; Golgi Organizasyonu dersi o odanın kendisini soracak. Memeli hücresinde Golgi yığınları çekirdeğin yanında, sentrozoma yakın bir yerde nasıl tek bir şerit (Golgi ribbon) hâlinde birleşir? Şeker dalını işleyen enzimler neden cis, medial ve trans bölmelere dağılmıştır ve golgin denen iskele proteinleri bu düzeni nasıl ayakta tutar? Hücre bölünürken bu şerit neden parçalanır?