Protein Katlanması

Pazartesi, kovalanan bantlar

Aralığın ikinci haftası soğuk başlıyor. Pazartesi sabahı ışıklı kutuda yine jel var, ama bu kez üç kabın hikâyesi aynı jelde yan yana dizilmiş. Ediz cuma akşamı kültürdeki salgı hücrelerine iki dakika boyunca işaretli amino asit vermiş, sonra işaretsiz ortama alıp belli aralıklarla örnek toplamış. Birinci kap olağan ortamda kalmış. İkinci kaba hücre içini indirgeyen bir kimyasal, üçüncüsüne şeker dalındaki glukozların kırpılmasını engelleyen bir madde eklenmiş.

Jel, disülfit bağlarını koparmayan koşulda koşturulmuş. Birinci kabın ilk şeridinde bant bulanık ve yukarıda; dakikalar ilerledikçe yukarıdaki gölgeler inceliyor, aşağıda keskin, hızlı koşan tek bir bant beliriyor. İkinci kabın bütün şeritlerinde bant en yukarıda donup kalmış, ortamda salgılanan ürün yok. Üçüncü kapta keskin bant birincidekinden erken belirmiş, fakat son şeritlerde soluk ve jelin tepesinde, kuyucuğun ağzında bir leke birikmiş.

"Cuma sizin sorunuzdu," diyor Ediz. "Zincir içeride kendi hâline kalmıyor galiba. Birileri onu bekletiyor."

Bu derste ne olacak

Katlanmanın fiziğiyle açıp ER'yi bir katlanma odası olarak tarif edeceğiz. Sonra üç kabı sırayla okuyacağız: disülfit bağlarını kuran ve düzelten enzimler, şeker dalını kullanan döngü ve döngüden çıkamayan zincirin yolu.

Mekanizma

Dizideki bilgi ve arama sorunu

Kimya modülünde zayıf etkileşimlerin protein biçimini nasıl ayakta tuttuğuna baktığımız derste Anfinsen'in ribonükleaz deneyini görmüştük: disülfit köprüleri çözülüp açılan enzim, koşullar düzelince kendiliğinden eski biçimine dönüyordu. NobelPrize.org, 1972 Kimya Ödülü'nün yarısını Anfinsen'e amino asit dizisi ile biyolojik olarak etkin biçim arasındaki bağlantı üzerine çalışması için verdiğini yazar; Wikipedia'nın Anfinsen maddesi deneyin üre ve bir indirgeyiciyle kurulduğunu ekler. Biçim dizide saklıdır. Ama bu bilgi, zincirin o biçime nasıl ulaştığını söylemez.

Levinthal 1969'da bu soruyu bir sayımla sordu. Wikipedia'nın aktardığı çerçevede yüz kalıntılık bir zincirin iki yüz dönme açısı vardır; her biri üç kararlı konumdan birini alabiliyorsa olası biçim sayısı 3²⁰⁰ ≈ 2,7 × 10⁹⁵ eder. Zincirin cömert bir varsayımla saniyede 10¹³ biçim denediğini düşünelim. Hepsini sırayla denemek 2,7 × 10⁹⁵ ÷ 10¹³ ≈ 2,7 × 10⁸² saniye, yani 8 × 10⁷⁴ yıl dolayında sürer; evrenin yaşı bunun yanında ihmal edilir. Oysa aynı madde küçük proteinlerin milisaniyeler, hatta mikrosaniyeler içinde katlandığını yazar. Zwanzig ile arkadaşlarının 1992 çalışmasının özeti de proteinlerin saniyeler ya da daha kısa sürede katlandığını söyler.

Çelişkiyi çözen, aramanın rastgele olmamasıdır. Zwanzig ekibi, yanlış yerel düzenlere karşı birkaç kT büyüklüğünde küçük bir enerji yanlılığının süreyi biyolojik ölçeğe indirdiğini gösterdi. Bugün bu tablo bir huni olarak çizilir: tepede çok sayıda açık biçim, aşağı indikçe daralan bir yüzey, dipte doğal biçim. Zincir her adımda biraz daha düşük enerjiye kayar ve sayımın öngördüğü yolların çoğuna hiç uğramaz.

Hunide başka çukurlar da vardır. Açıkta kalan yağ seven parçalar komşu zincirlerinkine yapışabilir. Katlanma tek zincirin kendi içinde düzenlenmesidir; kümelenme (agregasyon) ise birden çok zincirin yanlış yüzlerinden birbirine yapışmasıdır. Üçüncü kabın kuyucuk ağzındaki leke bu ikinci yolun izidir.

Kalabalık ve yükseltgen bir oda

Ribozomdan lümene giren zincir tüpteki ribonükleazın rahatlığında değildir. Braakman ile Hebert'in 2013 derlemesi, hücre içinin proteinle çok kalabalık olduğunu ve yeni zincirlerin bu yüzden yanlış katlanmaya ve kümelenmeye açık kaldığını vurgular. Zincir bir de parça parça gelir: cuma günkü hesapta beş yüz kalıntılık kurgu enzim bir buçuk dakikaya yakın, 89 saniye dolayında bitiyordu. Braakman ile arkadaşları katlanmanın ve disülfit kurulmasının zincir daha uzarken, N ucundan C ucuna doğru başladığını yazar. Birinci kapta keskin bandın yarısının kurgu olarak dört dakikada, yani 240 saniyede oluştuğunu varsayalım: 240 ÷ 89 ≈ 2,7. Zincir yapımı bittiği hâlde katlanma o sürenin iki katından uzun bir süre daha sürüyor.

Oda kimyasal olarak da farklıdır. Ushioda ile Nagata'nın 2019 derlemesi ER'nin sitozole göre yükseltgen olduğunu, glutatyon havuzunun orada çok daha yükseltgenmiş durduğunu aktarır; Braakman ekibi de lümeni disülfit kurmaya yetecek kadar yükseltgen bir bölme diye tanımlar. Antioksidan savunmayı işlediğimiz derste glutatyonun indirgenmiş ve yükseltgenmiş hâllerini tanımıştık; ER bu dengenin sitozoldekinden başka bir noktasında tutulur. Düz ER dersinde gördüğümüz yüksek lümen kalsiyumu da buranın bir özelliğidir ve aşağıdaki şaperonlardan bazıları iş görmek için kalsiyuma gereksinir.

Yardımcılar

Cuma günü BiP'i zinciri içeri çeken bir cırcır olarak görmüştük; lümende asıl işi bekçiliktir. Wikipedia'nın BiP maddesine göre BiP ısı şoku proteinlerinin Hsp70 ailesindendir. ATP bağlıyken bağlanma cebinin kapağı açıktır ve yüküne gevşek tutunur; ATP'yi yıkıp ADP taşıdığında kapak kapanır ve yağ seven parçayı sıkıca kavrar. Braakman ile Hebert'in derlemesindeki çizim de bu döngüdür. Bağlan, bekle, bırak: zincir her bırakılışta katlanmayı yeniden dener. KDEL dizisini, Golgi'ye kaçan ER proteinlerini geri çağıran bir etiket olarak kesecik trafiği dersinde tanımıştık. Munro ile Pelham 1987'de BiP'in ve birazdan tanıyacağımız izomerazın zincirlerinin bu diziyle bittiğini, BiP'in son kalıntıları silinince hücrenin onu salgıladığını gösterdi. Bekçi, kendi kapısını da kapalı tutar.

Wikipedia'nın PDI maddesi enzimin bağları hem kurduğunu hem kırdığını, iki etkin bölgesinin tiyoredoksine benzediğini yazar. Bağ kurarken indirgenen PDI'ı Ero1 adlı enzim yeniden yükseltger; elektronlar sonunda oksijene gider ve hidrojen peroksit oluşur. Ushioda ile Nagata aynı zinciri anlatır. Birinci kabın yukarıdaki gölgeleri, bağlarının bir kısmı kurulmuş ya da yanlış kurulmuş ara biçimlerdir; keskin alt bant bütün bağlarını doğru kurmuş, sıkılaşmış zincirdir ve bu yüzden jelde hızlı koşar.

İkinci kap bu zincirin ucunu keser. Braakman, Helenius ve Helenius 1992'de canlı hücrelere indirgeyici eklediklerinde yeni zincirin disülfit kuramadığını, zaten kurulmuş bağların ER içinde açıldığını gördüler. İndirgenmiş protein ER'den çıkmadı. İndirgeyici yıkanınca zincir hızla yükseltgendi, doğru katlandı ve Golgi'ye ilerledi.

Şeker dalı bir sayaç gibi

Cuma günü ikinci jelde şekerin yalnız lümende eklendiğini okumuştuk. Braakman ile Hebert'e göre eklenen dal üç glukoz, dokuz mannoz ve iki N-asetilglukozaminden kurulu hazır bir bloktur. Wikipedia'nın kalneksin maddesine göre glukozidaz I ve II uçtaki iki glukozu sırayla keser. Tek glukozlu kalan dal, zara bağlı kalneksinin ya da lümende serbest dolaşan kalretikülinin tutunabildiği biçimdir. Kalneksin yanında disülfit kuran bir başka yardımcıyı da getirir.

Halkayı kapatan UGGT adlı enzimdir. Braakman ile Hebert onu bir kalite denetimi algılayıcısı olarak tanımlar: yarı açık zinciri tanır ve dala glukozu geri takar. Katlanmış zincir glukozu geri almaz ve yoluna çıkar. Şeker, zincirin o anki hâlini okunabilir kılan bir etikettir.

Üçüncü kap tam burayı bozar. Hebert ile arkadaşları glukoz kırpılmasını engellediklerinde kalneksin ve kalretikülin zincire tutunamadı; disülfit kurulması ve zincirlerin birleşmesi iki kat hızlandı, ama kümelenme ve yıkım yüzünden olgun ürün azaldı. Zincir kalneksine kilitlendiğinde ise katlanma durdu. Denetim bağlanıp bırakmayla işler; hız tek başına bir kazanç değildir. Ediz'in erken beliren ama soluklaşan bandı ile kuyucuktaki leke bunu gösteriyor.

Bir hesap yapalım. Kurgu bir proteinin her turda doğru katlanma olasılığı 0,4 olsun. Beklenen tur sayısı 1 ÷ 0,4 = 2,5'tir. Üç tur sonra zincirlerin 0,6³ ≈ 0,22'si, beş tur sonra 0,6⁵ ≈ 0,08'i hâlâ katlanmamıştır. Döngü sonsuz dönseydi, bu kalan pay lümende birikirdi.

Katlanamayanın yolu

Döngüyü bitiren ikinci bir saattir. Olzmann ile arkadaşlarının 2013 derlemesine göre ER'deki mannozidazlar dalın uçlarından mannozları yavaş yavaş kırpar. Kırpılmış dal UGGT'ye uygun değildir, zincir artık kalneksine dönemez. Mannozu azalmış dalı tanıyan lektinler zinciri yıkıma ayırır. Wikipedia'nın ER ile ilişkili yıkım maddesi bu yolun adımlarını tanıma, zardan geri çıkarılma, ubikitinle işaretlenme ve proteazomda parçalanma olarak sıralar.

Ubikitin işaretinin ve proteazomun ayrıntıları proteostaz modülündeki Ubiquitin–Proteazom Sistemi dersinde işlenecek. Burada önemli olan sıradır: bekletmek, yeniden denemek ve süre dolunca geri çevirmek. ER'den çıkma izni, yalnız denetimi geçmiş bir zincire verilir.

Bazı kalıtsal hastalıklarda işlevi yerinde olabilecek bir protein, denetimi geçemediği için ER'de tutulup yıkılır; elektrolit dengesindeki taşıyıcı vakasında jelde ER'den çıkamayan bir kanal proteinini böyle görmüştük, ayrıntılar kendi derslerine aittir.

Modelin sınırı

• Huni bir benzetmedir. Büyük, çok bölümlü proteinlerin yüzeyi pürüzlüdür; ara durakları ve tuzakları vardır.
• Glutatyonun ER'deki oranı yöntemden yönteme değişen değerlerle ölçüldü ve yeniden tartışılıyor; yön sağlam, sayı değil.
• Deneylerin çoğu bir virüs glikoproteinine ve birkaç model proteine dayanır. Her proteinin kalneksin döngüsüne ne kadar bağımlı olduğu farklıdır.
• Tur olasılığı ve dört dakika kurgudur. Gerçekte her tur aynı olasılıkla dönmez ve mannoz saati kesin bir tur sayısıyla işlemez.

Bu ders neyi göstermiyor

• Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler.
• Şaperonların ve katlanma enzimlerinin varlığı, "protein katlanmasını destekleyen", "şaperonları artıran" ya da "ısı şoku proteinlerini çalıştıran" diye sunulan hiçbir ürüne, sıcak ya da soğuk uygulama programına veya amino asit karışımına dayanak olamaz.

Pazartesi öğleden sonra

Ediz defterine bir halka çiziyor: dala takılı üç küçük daire, iki makas, tek daireyle kalneksine tutunan zincir, bırakılış, UGGT'den geri dönen bir ok. Halkanın dışına ikinci bir ok ekleyip ucuna "mannoz ↓, süre doldu" yazıyor. İkinci kabın satırına yalnız "bağ yok, kapı kapalı" notu düşüyor.

Suzan Hanım üçüncü kabın kuyucuğundaki lekeye bakıyor. "Bekletmek de bir iş," diyor. "Ama bir sabah bu hücrelere katlayabileceklerinden çok zincir gelirse ne olur? ER bunu fark eder mi?"

Kendini sına

1. Yüz kalıntılık zincirde her açı iki konum alsaydı, saniyede 10¹³ denemeyle arama kaç saniye sürerdi? Sonuç sorunu çözer mi?
2. İndirgemeyen jelde katlanmış biçim neden daha hızlı koşar? Aynı örnek indirgeyen jelde koşturulsa bantlar nasıl görünürdü?
3. İkinci kabın hücreleri yıkanıp olağan ortama alınırsa bant ne yapar? Bu neyi gösterir?
4. Tur başına doğru katlanma olasılığı 0,25 olsaydı beklenen tur sayısı ve üç tur sonra katlanmamış pay ne olurdu?
5. Glukoz kırpılmasını engellemek katlanmayı hızlandırıyorsa, kalneksin döngüsü neden zararlı bir yavaşlatıcı olarak görülmez?

Bir sonraki derse köprü

Öğleden sonraki soru tek zincirden bütün lümene geçiyor. Katlanmamış Protein Yanıtı dersi şunu soracak: katlanmamış yük biriktiğinde ER bunu nasıl algılar, BiP'in zardaki algılayıcılardan ayrılması neden bir alarm sayılır? IRE1, PERK ve ATF6 adlı üç kol çeviriyi nasıl yavaşlatır, şaperon yapımını nasıl artırır ve stres uzadığında hücreyi hangi noktada ölüm kararına götürür?