Genomun Üç Boyutlu Düzeni

Kırmızı kenarda, yeşil ortada

Cuma, kasımın dördüncü haftası. Gece yağan yağmur durmuş, bodrumun penceresinden ıslak bir kaldırım görünüyor. Meliha Hanım elektron mikroskobunu bugün kapalı bırakmış; komşu odadaki floresan mikroskobunun başında, genetik bölümünden bir meslektaşının gönderdiği lamı yerleştiriyor. Lamda kan lenfositleri var. Çekirdekleri biçimleri bozulmadan sabitlenmiş, iki kromozom boyunca dizilen işaretli DNA parçalarıyla boyanmış: on sekizinci kromozom kırmızı, on dokuzuncu yeşil.

Barlas ilk çekirdekte iki kırmızı leke ve iki yeşil leke sayıyor. Hiçbiri çekirdeğe yayılmış bir iplik gibi durmuyor; her kromozom kendi yuvarlakça öbeğini doldurmuş. Kırmızılar çekirdeğin kenarına yaslanmış, yeşiller ortaya yakın. İkinci ve üçüncü çekirdekte düzen aynı yönde, ama tam aynı yerlerde değil. "Bizim fibroblastlarda da böyle mi durur?" diye soruyor. Meliha Hanım başını sallıyor: "Onların çekirdeği yassı. Orada kural biraz değişir."

Sonra ekrana bir temas haritası açıyor. Köşegen boyunca koyu kareler diziliyor; bazı karelerin köşesinde parlak bir nokta var. Köşegenden uzaklaştıkça renk soluyor, en uzak bölgede dama tahtasını andıran bir desen beliriyor. "Bu kaç hücrenin görüntüsü?" diye soruyor Barlas. "Milyonlarca," diyor Meliha Hanım. "Hiçbiri tek başına böyle görünmüyor."

Bu derste ne olacak

Ölçekte yukarıdan aşağı ineceğiz: önce bütün kromozomların çekirdekteki bölgeleri, sonra açık ve kapalı kromatinin toplandığı iki bölme, en sonda bir megabaz dolayındaki komşuluklar ve onları kuran döngüler. Hesapta bir döngünün kurulma süresini hücrenin ömrüyle karşılaştıracağız.

Mekanizma

Her kromozomun bir bölgesi

Cremer ile Cremer'in 2010 derlemesi fikrin geçmişini on dokuzuncu yüzyıla, Carl Rabl'ın 1885 önerisine götürür; Theodor Boveri de bölünmede görülen her kromozomun ara evrede bireyliğini koruyup çekirdeğin belirli bir kısmını tuttuğunu savunmuştur. Aynı derlemeye göre bu bölgeleri doğrudan göstermek, seksenlerin ortasında geliştirilen yerinde melezleme yöntemleriyle mümkün oldu. Wikipedia'nın maddesi de kanıt olarak kromozom boyamayı sayar.

Barlas'ın lamındaki düzeni de bu yöntem gösterdi. Croft ve arkadaşlarının 1999 tarihli çalışmasının özetine göre boyları birbirine yakın on sekizinci ve on dokuzuncu kromozom gen içeriğinde belirgin biçimde ayrılır; on dokuzuncu daha içeride durur, on sekizincinin kenardaki yeri hücre döngüsünün başında kurulur. Cremer ile Cremer de gen bakımından zengin on dokuzuncunun lenfosit çekirdeğinin içinde, gen fakiri on sekizincinin kenarında bulunduğunu aktarır.

Kromatin Organizasyonu dersinde bir fibroblast çekirdeğinin on mikrometrelik çapına iki metreyi aşkın DNA sığdığını, ardışık iki baz çifti arasındaki adımın 0,34 nanometre olduğunu görmüştük. Aynı ölçüyle bir megabazlık parça düz hâlde 10⁶ × 0,34 nm = 340 mikrometre eder. Bu, Barlas'ın ölçtüğü çekirdeğin otuz dört katıdır. Kromozom bölgesi bu yüzden sayısız kez katlanmış bir yumağın adresi olarak okunmalıdır.

İki bölme: açık ve kapalı

Bölgelerin içini haritalamak için başka bir yöntem gerekti. Lieberman-Aiden ve arkadaşlarının 2009'da Science'ta yayımlanan çalışmasının özeti Hi-C'yi, yakınlığa dayalı birleştirmeyi yüksek hacimli dizilemeyle eşleyen bir yöntem diye tanıtır. Wikipedia'nın iki maddesi adımları sıralar. Hücreler formaldehitle sabitlenip birbirine yakın DNA parçaları çapraz bağlanır. DNA bir kesim enzimiyle parçalanır, uçlar biyotinle işaretlenip birleştirilir, oluşan melez parçalar dizilenir. İki uzak dizinin aynı parçada kaç kez buluştuğu, harita üzerindeki bir hücrenin rengini belirler.

İlk haritalar bir megabaz çözünürlükteydi ve kromozom bölgelerini doğruladı; özet küçük, gen zengin kromozomların birbirine yakın durduğunu da not eder. Asıl yenilik başkaydı: açık ve kapalı kromatin genom boyunca iki bölmeye ayrışıyordu. Wikipedia bunları etkin A ve baskılanmış B bölmeleri diye adlandırır. Ekrandaki dama tahtası bu ayrışmadır: aynı türden bölgeler, zincirde birbirinden uzak olsalar da, daha sık buluşur.

Komşuluklar ve döngüler

2012'de iki ekip aynı yapıyı daha ince ölçekte buldu. Dixon ve arkadaşları insan ve fare haritalarında megabaz boyutlu, kendi içinde sık temas eden alanlar tarif etti; alanlar hücre tipleri arasında kararlıydı ve sınırlarında CTCF adlı yalıtıcı protein birikiyordu. Nora ve arkadaşları fare X kromozomunun bir bölgesinde 200 kilobaz ile bir megabaz arasında değişen alanlar gördü ve bugün yaygın olan adı kullandı. Wikipedia'nın maddesi insanda ortalama boyu bin kilobaz verir.

Kaba bir sayım yapalım. Kromatin dersinde kullandığımız 3,1 milyar baz çiftilik tek takım genom bir megabazlık parçalara bölünürse 3,1 × 10⁹ ÷ 10⁶ ≈ 3100 alan çıkar. Dixon ekibi de fare embriyonik kök hücrelerinde 2200 alan saymış ve bunların genomun yüzde doksan birini kapladığını bulmuştur.

Karelerin köşesindeki parlak noktalar döngü tabanlarıdır. Rao ve arkadaşlarının 2014'te Cell'de yayımlanan bin baz çözünürlüklü haritalarında yaklaşık on bin döngü sayıldı. Tabanlar çoğunlukla alan sınırlarındaydı ve CTCF bağlıyordu. Döngü tabanlarındaki CTCF bağlanma dizilerinin yüzde doksanından fazlası ters yönlüydü, yani iki dizi birbirine bakıyordu.

Halka ipi çekiyor

Bu yön kuralını açıklayan model döngü ekstrüzyonudur. Wikipedia'nın maddesi ve Davidson ekibinin çalışması kohesini, DNA'yı içine alabilen, halka biçimli bir ATPaz kompleksi olarak tarif eder. Fudenberg ve arkadaşlarının 2016 benzetimlerinde kohesin DNA'ya yüklenip onu iki yandan içinden geçirir, döngü gitgide büyür ve kohesin sınırdaki CTCF'ye takılınca durur. Aynı çalışma her alanın tek ve durağan bir döngüden değil, sürekli kurulup çözülen birçok döngüden doğduğunu vurgular.

Model neden birbirine bakan dizileri ister? Sanborn ve arkadaşları 2015'te on üç genom düzenleme deneyinde CTCF dizilerinin yönünü ve yerini değiştirdiler. Yön kuralı etkilenen döngüleri her seferinde doğru öngördü; tek baz çiftilik bir değişiklikle döngü bozulabildi ya da başka yere taşınabildi. 2019'da iki ekip süreci tek molekül düzeyinde gözledi. Davidson ekibine göre tek bir insan kohesini döngüyü iki yöne simetrik olarak, saniyede 2,1 kilobaza varan hızla büyütür. Kim ekibi ise hem çıplak hem nükleozomlu DNA'da ortalama saniyede 0,5 kilobazlık bir sıkıştırma ölçtü; iki çalışmada da süreç ATP yıkımına bağlıydı.

Bir döngü kaç dakikada kurulur

Bir megabazlık döngü, ortalama hızla 10⁶ ÷ 500 = 2000 saniyede, yani yaklaşık otuz üç dakikada kurulur. Davidson ekibinin üst hızıyla 10⁶ ÷ 2100 ≈ 480 saniye, sekiz dakika dolayı yeter. Hücreden gelen ölçüm bu mertebeyle uyuşur: Rao ekibinin 2017'deki çalışmasında kohesin yıkılıp geri verildiğinde megabazlık döngülerin birçoğu bir saatten kısa sürede yeniden kuruldu. Günde bir bölünen varsayımsal bir hücrede 24 × 60 ÷ 33 ≈ 43 eder; aynı döngü bir hücre ömrü içinde onlarca kez çözülüp yeniden çekilebilir.

Döngü gidince bölme kalır

Bölme ile döngünün ayrı işlediğini gösteren deney de aynı çalışmadadır. Rao ekibi kohesini hızla yıkan hücrelerde bütün döngü alanlarının kaybolduğunu, bölme alanlarının ve histon işaretlerinin ise yerinde kaldığını gördü. Nora ve arkadaşları 2017'de CTCF'yi fare kök hücrelerinde yıktılar. CTCF bölgeleri arasındaki döngüler ve alanların yalıtımı dozla bağlantılı biçimde bozuldu, ama etkin ve pasif bölmeler doğru ayrışmayı sürdürdü.

Kenar ve nükleolus

Kromatin Organizasyonu dersinde laminaya yaslanan koyu kuşağı görmüş, adını koymadan bırakmıştık. Guelen ve arkadaşları 2008'de insan fibroblastlarında genomun laminayla temas eden yerlerini haritaladılar: 1300'den fazla, 0,1 ile 10 megabaz arası, genleri az yazılan bölge. Bunlara laminaya bağlı bölge (lamina-associated domain, LAD) dendi. Van Steensel ile Belmont'un 2017 derlemesi insan ve fare hücrelerinde bin ile bin beş yüz LAD verir, ortanca boyu yarım megabaz ve toplamı genomun üçte birinden fazla sayar. 3,1 milyar baz çiftinin üçte biri bir milyar baz çiftini aşar. Derlemenin kendi hesabı kromatin dersimizdeki boncuklarla örtüşür: 500.000 ÷ 200 = 2500 nükleozom.

Nükleolus dersindeki koyu halkanın da bir haritası var. Van Koningsbruggen ve Németh ekiplerinin 2010 çalışmaları, çoğu kromozomdan belirli dizilerin nükleolusa yaslandığını ve bu nükleolusa bağlı bölgelerin (NAD) gen bakımından fakir, sessiz bölgeler olduğunu gösterdi; van Steensel ile Belmont bunların LAD'lerle kısmen örtüştüğünü yazar.

Uzak bir düzenleyici bölgenin bir gene yaklaşması da bu düzene bağlanır. Rao ekibi döngülerin sık sık promotörlerle güçlendiricileri birleştirdiğini bildirir. Bu buluşmanın bir geni nasıl açtığını Promotör ve Enhancer dersi (L03-P03-M04-D03) işleyecek. Nora ekibi alan sınırlarını bozan kromozom yeniden düzenlenmelerinin hastalıkla bağına dikkat çeker, Wikipedia da bunları bazı gelişim bozukluklarıyla ve kanserlerle ilişkilendirir; tanı ve tedavi buradaki anlatının dışında kalır.

Modelin sınırı

• Barlas'ın lamındaki düzen lenfositlere aittir. Bolzer ekibinin 2005 çalışması ve Cremer ile Cremer'in derlemesi yassı fibroblast çekirdeğinde bölgelerin gen yoğunluğundan çok kromozom boyuna göre dizildiğini yazar; düzen her hücre tipinde olasılıksaldır, kesin bir adres değildir.
• Hi-C bir ortalamadır. Temas sıklığı bir olasılığı ölçer; iki bölgenin aynı hücrede aynı anda buluştuğunu ya da ne kadar süre bir arada kaldığını söylemez.
• Ekstrüzyon hızları arıtılmış proteinle, gerilen tek DNA üzerinde ölçüldü. Kim ekibi sıkıştırmanın uygulanan kuvvete duyarlı olduğunu yazar; hücredeki nükleozomlar, yazılan genler ve öteki proteinler hızı değiştirebilir.
• Bintu ekibinde kohesin yıkıldığında nüfus ortalamasındaki alanlar silindi, ama tek hücrelerdeki alan benzeri öbekler kaldı; yalnız sınırların tercihli yerleri kayboldu. Tek hücredeki yapının neyle kurulduğu açık bir sorudur.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Genomu yeniden düzenlediği, gen ifadesini optimize ettiği ya da DNA'yı hizaladığı söylenen hiçbir takviye, protokol, cihaz ya da frekans uygulaması bu haritalardan dayanak alamaz. Bir döngünün kurulabildiğini bilmek, bir kişinin genomunda hangi döngünün değiştiğini ölçmek anlamına gelmez.

Mikroskop kapanırken

Barlas defterine iç içe dört katman çiziyor. En dışta çekirdek ve içinde iki renkli öbek, "bölge"; onun içinde dama tahtası, "A / B"; sonra köşegende üç kare, "TAD, ≈ 1 Mb, ≈ 3100"; en içte bir halkadan geçen ilmek, "0,5–2 kb/s, 1 Mb ≈ 8–33 dk". Kenara bir satır daha ekliyor: "Kohesin gidince kareler gidiyor, dama tahtası kalıyor."

Meliha Hanım lamı kutusuna geri koyuyor. "İki haftada zarı, poru, kromatini, nükleolusu, taşımayı ve şimdi bu yerleşimi gördük," diyor. "Hepsini tek bir sayfada buluşturmanın zamanı geldi."

Kendini sına

1. Bir megabazlık DNA'nın düz uzunluğunu hesapla ve altı mikrometrelik bir çekirdeğin çapıyla karşılaştır.
2. Hi-C haritasında köşegen boyunca dizilen kareler ile uzak bölgelerdeki dama tahtası deseni hangi iki düzeye karşılık gelir?
3. Döngü tabanındaki CTCF dizilerinden biri ters çevrilirse ekstrüzyon modeli ne öngörür? Sanborn ekibinin deneylerine bağla.
4. Kohesin yıkıldığında hangi yapıların kaybolup hangilerinin kaldığını yaz. Bu sonuç bölmeleşme hakkında ne söyler?
5. Ortalama hız saniyede bir kilobaz olsaydı iki megabazlık bir döngü kaç dakikada kurulurdu?

Bir sonraki derse köprü

Zarfı elektron mikroskobunda, poru dondurma-kırma kopyasında, taşımayı floresanla, genomun yerleşimini boyama ve temas haritasıyla izledik. Çekirdek Görsel Atlası bu parçaları aynı görselde buluşturacak: nanometrelik por ile megabazlık alan aynı çizimde nasıl gösterilir, ve hangi ölçek hangi yöntemle, yani elektron mikroskobu, floresan ya da Hi-C ile görülebilir?