Nükleer Taşınım

Üç kuyucuk ve kanaldaki taneler

Çarşamba, kasımın dördüncü haftası. Limandan kalkan sis bodrum penceresinin önünde asılı duruyor. Meliha Hanım yan odadaki konfokal mikroskoptan cam tabanlı bir kap ödünç almış; üç kuyucukta aynı fibroblastlar büyüyor. Hücrelere floresan bir yük yaptırılmış: iki floresan protein arka arkaya eklenmiş, porun kendiliğinden geçirdiği boyun üstüne çıkarılmış.

Birinci kuyucukta ışık sitoplazmaya yayılmış, çekirdek karanlık bir delik gibi duruyor. İkincide yükün ucuna yalnız yedi amino asit eklenmiş, bu kez çekirdek parlıyor. Barlas iki bölmenin parlaklığını ölçüp bölüyor: çekirdek sitoplazmanın otuz katı. Üçüncü kuyucuktaki hücrelerin enerjisi yarım saat önce tüketilmiş; çekirdeğin kenarı silikleşmiş, ışık iki yana eşitlenmeye başlamış.

Sonra elektron mikroskobunun ekranı. Aynı yük altın tanelere kaplanıp bir hücrenin sitoplazmasına verilmiş, birkaç dakika sonra hücre sabitlenmiş. Kesitte siyah taneler por kanallarının ortasında dizilmiş; birkaç tanesi sitoplazmaya sarkan ipliklerin ucunda bekliyor. "Kanal iki yönlü," diyor Barlas. "İçinde tek yönlü bir vana mı var?" Meliha Hanım başını iki yana sallıyor: "Adresi yük taşıyor. Yönü başka biri veriyor."

Bu derste ne olacak

Önce adresin yükün dizisinde nasıl yazıldığını okuyacağız. Sonra taşıyıcı aileyi ve Ran'ın iki yüzünü tanıyıp içe ve dışa giden döngüleri kuracağız. Kapanışta Barlas'ın otuz katının enerji faturasını çıkarıp Nükleolus dersindeki trafiğin kaç GTP'ye mal olduğunu hesaplayacağız.

Mekanizma

Adres yükün içinde yazılı

Wikipedia'nın maddesi ile Lu ve arkadaşlarının 2021 derlemesi aynı başlangıcı anlatır: ilk çekirdek sinyali, bir maymun virüsünün, SV40'ın büyük T antijeninde bulundu ve yedi amino asitti, PKKKRKV. Kalderon ve arkadaşlarının 1984 makalesi iki kaynakta da bu buluşun dayanağıdır. Lu ekibi dizinin ortasında art arda beş artı yüklü kalıntı bulunduğunu, üçüncü lizin treonine çevrilince taşımanın kaybolduğunu yazar.

Her sinyal tek parça değildir. Nükleoplazmin adlı kurbağa proteininde iki bazik küme, yaklaşık on amino asitlik bir arayla ayrılır; iki kaynak diziyi KR, ara parça, KKKK diye verir ve bu iki parçalı biçimi klasik sinyalin öbür ana türü sayar.

Ters yöndeki adres başka bir alfabeyle yazılır. Wikipedia'nın maddesine göre çıkış sinyali dört hidrofobik kalıntıdan oluşur ve bunlar çoğu kez lösindir. Stewart'ın 2022 derlemesi bu sinyali eksportin-1'in, klasik giriş sinyalini importin-α'nın tanıdığını yazar.

Veziküler Trafik dersinde ER'den kaçan proteini geri getiren KDEL dizisini görmüştük. Aynı fikir burada iki yönlü çalışır: yük, gideceği bölmenin adresini kendi zincirinde taşır.

Taşıyıcılar

Karyoferin adı porun yapısını işlediğimiz derste yalnız bir kez geçmişti: ağ bu taşıyıcıyı dışlamıyor, FG tekrarlarına geçici olarak tutunduğu için içine kabul ediyordu. Wikipedia'nın importin maddesi ile Lu ekibi en iyi bilinen yolu iki parçalı anlatır. İmportin-α adaptördür, yükün sinyalini tutar; importin-β porla konuşur ve kanaldaki FG kalıntılarını yüzeyindeki sığ, yağ seven ceplere oturtur. Lu ekibine göre importin-β yüke doğrudan dokunmaz, yalnız importin-α'yı pora yönlendirir.

Wikipedia'nın maddesi eksportin-1'in, öbür adıyla CRM1'in, yüzlerce proteinin yanında ribozom alt birimlerinin ihracında da rol aldığını yazar. Olgun mesajların çoğu ise başka bir taşıyıcıyla çıkar; Stewart'ın derlemesi ve Wikipedia bu yolu NXF1 adlı ihraç reseptörüne verir, ayrıntısını RNA İşlenmesi dersi açacak.

Ran: iki yüzlü anahtar

Wikipedia'ya göre Ran yaklaşık 25 kilodaltonluk küçük bir GTPazdır; Stewart da aynı kütleyi verir. Veziküler Trafik dersinde tanımladığımız Rab gibi, GTP bağlıyken bir biçime, GDP bağlıyken öbürüne geçer. Burada önemli olan anahtarın hangi bölmede hangi konumda durduğudur.

Bu dağılımı iki enzim kurar. GDP'yi GTP ile değiştiren RCC1, Wikipedia'ya ve Stewart'a göre kromatine bağlıdır, dolayısıyla çekirdekte kalır. GTP'nin yıkımını hızlandıran RanGAP, Wikipedia'nın maddesine ve Stewart'a göre hayvan hücrelerinde porun sitoplazma ipliklerindeki Nup358'e tutunur. Riddick ile Macara'nın 2005 modeli aynı asimetriye dayanır ve GDP'li Ran'ı çekirdeğe geri taşıyan NTF2'yi de hesaba katar. Böylece çekirdeğin içi GTP'li, dışı GDP'li Ran'la dolar.

İçeri giden döngü

Sitoplazmada importin-α sinyali tutar, importin-β ona bağlanır. Üçlü, Nükleer Por Kompleksi dersindeki FG ağının içinden geçer. Çekirdekte GTP'li Ran importin-β'ya bağlanır; Lu ekibine göre bu bağlanma importin-β'nın biçimini değiştirir, importin-α'yı serbest bırakır ve yük çözülür. Wikipedia'nın importin maddesi importin-α'nın kendi ucunda sinyale benzeyen bir parça taşıdığını, bu parçanın yükün yerine kıvrılarak bırakmayı kolaylaştırdığını ekler.

Taşıyıcılar yüksüz döner. İmportin-β GTP'li Ran'la, importin-α CAS adlı bir ihraç taşıyıcısı ve yine GTP'li Ran'la sitoplazmaya çıkar. Orada RanGAP, RanBP1'in yardımıyla, GTP'yi yıkar; GDP'li Ran taşıyıcıya tutunamaz ve importinler yeni tura hazır olur.

Dışarı giden döngü

İhraç aynı anahtarı ters sırayla kullanır. Wikipedia'nın maddelerine ve Stewart'a göre çekirdekte eksportin, yük ve GTP'li Ran bir üçlü kurar; eksportin yüke ancak Ran de bağlıyken sıkı tutunur. Üçlü pordan geçer, sitoplazmada RanGAP'in uyardığı GTP yıkımıyla dağılır ve yük bırakılır.

Yönü kim verir

Nachury ile Weis 1999'da PNAS'ta çarpıcı bir deney yayımladı: sitoplazmaya yüksek miktarda GTP'li Ran konunca iki farklı ihraç yükü GTP yıkımı olmadan çekirdeğe girdi. Aynı çalışma kompleksin pordan geçişinin GTP yıkımına bağlı olmadığını, yönü esas olarak Ran-GTP'nin bölmelenmiş dağılımının belirlediğini sonuçlandırır. Stewart da RCC1 ile RanGAP'in yerleri değiştirilince taşımanın tersine döndüğünü aynı çalışmaya dayanarak aktarır.

Stewart bu düzeni ısıl mandal (thermal ratchet) diye adlandırır: enerji malzemeyi pordan itmek için değil, yükün doğru bölmede bağlanıp doğru bölmede bırakılması için harcanır. Hareketin kendisini Brown Hareketi dersindeki ısıl hareket sağlar. Birincil Aktif Taşıma dersindeki pompada yönü, ATP'nin fosfatının iyon hapsedildiği anda proteine bağlanması kilitliyordu; burada kilit taşıyıcının üstünde değil, zarfın iki yanındaki Ran farkındadır.

Otuz katın bedeli

Barlas'ın ikinci kuyucuğunda yük çekirdekte sitoplazmadakinin otuz katına çıkmıştı. Derişim farkına karşı yapılan birikim, kendiliğinden eşitlenmeye giden sürecin tersidir ve bedeli ödenmelidir. Aktif Taşıma dersinde 37 °C için RT'yi 2579 J/mol almıştık. Bir mol yükü otuz katlık farka taşımak RT × ln 30 = 2579 × 3,40 ≈ 8,8 kJ ister. Her on katın 5,94 kJ tuttuğunu Denge Sabiti dersinden biliyoruz: 1,48 × 5,94 ≈ 8,8.

Aktif Taşıma dersinde hücre içindeki ATP yıkımına da yaklaşık 57 kJ/mol vermiştik. OpenStax'in biyoloji kitabı GTP'nin enerjice ATP'ye denk olduğunu yazar; Wikipedia'nın maddesi de GTP'nin bir enzimle kolayca ATP'ye çevrildiğini not eder. GTP'yi kaba bir varsayımla 57 kJ sayarsak 8,8 ÷ 57 ≈ 0,15 eder: tek bir yıkım, otuz katlık birikimin bedelini altı kereden fazla karşılar. Kalan pay, Birincil Aktif Taşıma dersindeki pompada olduğu gibi döngünün geri dönmemesine gider. Kurgu kaptaki üçüncü kuyucuk bu yüzden eşitleniyordu: enerji tükenince Ran farkı söner, pordan sızma sürer ama yükü geri toplayan bir şey kalmaz.

Trafiğin faturası

Nükleolus dersinde bir HeLa hücresinin çekirdeğine saniyede yaklaşık 5000 ribozom proteini girmesi gerektiğini bulmuştuk. Her içe taşıma turunda taşıyıcıyı serbest bırakmak için en az bir GTP yıkılır; importin-α'nın da kullanıldığı yolda ikinci bir Ran-GTP CAS ile birlikte dışarı çıktığı için tur daha pahalıdır. En sade varsayımla bu proteinler saniyede en az 5000 GTP ister; dışarı çıkan 125 alt birim buna en az 125 daha ekler.

Por başına hesap şöyledir: 5000 ÷ 3000 ≈ 1,7 tur. Tek bir porun saniyede bine varan geçişe izin verdiğini kanalın içini tartarken görmüştük; ribozom proteinleri bu kapasitenin binde ikisinden azını kullanır. Birincil Aktif Taşıma dersindeki kurgu hücrede bir milyon pompa saniyede yüzer döngüyle 10⁸ ATP yakıyordu; 10⁸ ÷ 5000 = 20.000, yani bu içe akışın enerji payı pompanınkinin yirmi binde biridir. Hesap yalnız ribozom proteinlerini sayar ve öbür yüklerin payını dışarıda bırakır.

Açılıp kapanan adres

Sinyal her zaman okunur durumda değildir. Lu ekibi fosforlanma ve fosfat sökülmesini taşımayı düzenleyen en iyi bilinen yol sayar; Wikipedia'nın maddesi de çıkış sinyallerinin maskelenip açılabildiğini yazar. Bir transkripsiyon faktörünün hangi koşulda çekirdeğe girdiğini Transkripsiyon Faktörleri dersi, sinyali açıp kapayan enzimleri Protein Kinazlar dersi işleyecek.

Derlemeler bazı virüslerin çekirdeğe girip çıkarken bu taşıyıcıları kullandığını, eksportin-1'i engelleyen bir ilacın da kan kanserlerinde onay aldığını bildirir; bu bilgiler bir tedavi seçimine buradan taşınmaz.

Modelin sınırı

• Anlatılan döngü klasik importin-α/β yoludur. Wikipedia'nın maddesine göre klasik olmayan sinyalleri importin-β ailesinin başka üyeleri doğrudan tanır; ribozom proteinlerinin de kendine özgü alıcıları vardır.
• Hesap her içe tura bir GTP verdi. Tur başına harcanan GTP sayısı yola göre değişir ve taşıyıcılar Stewart'ın belirttiği gibi porun içinde gidip gelebilir; sayı bir alt sınırdır.
• Otuz kat kurgu bir ölçümdür. Semmelink ekibinin 2021 derlemesine göre aynı taşıyıcıyı paylaşan yükler yarışır; bir yükün artışı öbürlerinin çekirdek/sitoplazma oranını düşürür.
• GTP'yi 57 kJ saymak kaba bir varsayımdır. Hücre içi değer GTP, GDP ve fosfatın o anki derişimlerine bağlıdır.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Hücre içi iletişimi ya da gen ifadesini düzenlediği, hücreyi içeriden beslediği ya da çekirdeğe ulaştığı söylenen hiçbir takviye, peptit veya ürün bu döngüden destek alamaz. Yükün adresini okumak, bir maddenin bir kişide o adrese gittiğini göstermez.

Kuyucuğun kenarındaki not

Barlas defterine zarfı çiziyor: içeride "Ran-GTP", dışarıda "Ran-GDP". İçe giden oka "NLS, importin, bırak", dışa gidene "NES, eksportin, bırak" yazıyor; sitoplazmadaki köşeye küçük bir yıldız ve "GTP burada yıkılır". Altına iki satır: "30 kat = 8,8 kJ", "5000 GTP/s, por başına 1,7".

Meliha Hanım kuyucuğun kenarındaki karanlık çekirdeğe bakıyor. "Yük içeride nereye gidiyor, onu henüz sormadık," diyor. "Cuma kromozomların çekirdekte nerede oturduğuna bakacağız."

Kendini sına

1. PKKKRKV dizisi eklenen bir protein neden çekirdekte birikir? Üçüncü lizin treonine dönerse ne beklersin?
2. İçe taşımada yük hangi bölmede bağlanır, hangisinde bırakılır? Her iki olayda Ran hangi nükleotidi taşır?
3. RCC1 sitoplazmaya, RanGAP çekirdeğe taşınsaydı bir çıkış sinyali taşıyan yük hangi yöne giderdi? Cevabını Nachury ile Weis'in deneyine bağla.
4. Çekirdek/sitoplazma oranı 100 olan bir yük için gereken serbest enerjiyi hesapla; sonucu hücre içindeki bir ATP yıkımının verdiği enerjiyle kıyasla.
5. "Por, yükü enerji harcayarak iter" diyen birine ısıl mandal fikriyle cevap ver.

Bir sonraki derse köprü

Yükün çekirdeğe nasıl girdiğini gördük; içeride nerede durduğu ise çekirdeğin kendi düzenine bağlı. Bir sonraki durak Genomun Üç Boyutlu Düzeni: her kromozom çekirdekte kendi bölgesini (chromosome territory) mi tutar, kohesin ve CTCF DNA'yı nasıl döngülere katlayıp TAD denen komşuluklar kurar, ve Hi-C temas haritası laminaya yaslanan bölgelerle çekirdeğin ortasındakileri nasıl ayırır?