Doku Sertliği ve Hücre Davranışı

Beş haftalık jeller

Kasımın ikinci çarşambası. Bilecik'te öğleden sonra rüzgâr dönmüş, vadiden gelen hava odun dumanı kokuyor. Necla Hanım ekimin ilk haftasında bir dizi kolajen jeli fibroblastlarla dökmüş, her hafta bir kuyucuğu ölçüp kalanları inkübatöre geri koymuş. Bir sırada hücre yok; bir sırada hücreler var; üçüncü sıranın besiyerine lizil oksidazın işini durduran bir çapraz bağ engelleyici eklenmiş.

Oylum tezgâhtaki girinti aletinin başında. Ucu küre biçimli ince bir çubuk jelin yüzeyine birkaç mikrometre gömülüyor, alet direnç kuvvetini okuyor, ekran bir sertlik değeri yazıyor. Tablo beş hafta geriye uzanıyor. Hücresiz jel ilk günkü 0,4 kilopaskalda duruyor. Hücreli jel her hafta biraz daha dirençli: 0,4, 0,6, 0,9, 1,3, 1,9 ve bugün 2,4. Engelleyicili sıra 0,4'ten ancak 0,6'ya çıkmış. Necla Hanım aynı sıralardan dün sabitlediği lamelleri floresan mikroskoba koyuyor. Hücreli jeldeki fibroblastların içinden boydan boya parlak yeşil lifler geçiyor; engelleyicili jelde yeşil yalnız birkaç hücrede, o da soluk.

"Hücreler jeli sertleştirmiş," diyor Oylum. "Ama sertleşen jel de hücreleri değiştirmiş gibi."

Bu derste ne olacak

Dokunun sertliğini tek bir bileşene bağlamanın neden yetmediğini görecek, hücrenin matriksi yeniden yazışını ve matriksin hücreye dönüşünü aynı döngüde birleştireceğiz. Döngüyü haftalık bir hesapla koşturup frenin nerede durduğunu arayacak, sonra "bu dokunun sertliği şu kadar" cümlesinin neden eksik olduğunu soracağız.

Mekanizma

Sertliği ne kurar

Kolajen, elastin ve proteoglikanları işlediğimiz derste her bileşenin mekanik işini tek tek görmüştük: kolajen lifi çekmeye direnir, elastin geri döner, eksi yüklü zincirlerin tuttuğu su basınca karşı koyar. Doku ölçeğinde bu işler toplanır ve oranları sertliği belirler.

Handorf ve arkadaşlarının 2015 derlemesi çapraz bağların lizil oksidaz ailesinin işi olduğunu, bu enzimlerin yapımının kolajen birikimine yanıt olarak arttığını ve çapraz bağ artışının sertliği yükselttiğini yazar. Wikipedia'nın lizil oksidaz maddesi çapraz bağlanmayı kolajen fibrillerinin kararlılığı için zorunlu sayar ve enzimi deneysel olarak engellemenin hayvanlarda zayıf bağlara, aşırı esneyen deriye ve kemik zayıflığına yol açtığını aktarır. Oylum'un engelleyicili sırası bu yüzden yumuşak kaldı: hücreler kolajeni çekebildi, ama çektikleri lifleri birbirine kilitleyemedi.

Yönelim de bir etkendir. Pikrosirius kırmızısıyla bakılan tendon kesitinde demetlerin parlaklığının tablayla dönüşünü hatırlayalım; bu parlaklık liflerin tek bir yöne dizildiğini gösteriyordu. Atardamar duvarının küçük gerilmede yükü elastine bırakıp kıvrık kolajeni ancak açıldığında devreye soktuğunu da o derste okumuştuk: aynı lif, yüke paralel ve gergin olduğunda sertliğe katılır, kıvrık ya da yüke dik durduğunda katılmaz.

Hücre matriksi yeniden yazar

Hücre, matriksin yalnızca okuru değildir. Handorf ekibi hücrelerin hücre dışı matriksin bileşenlerini sürekli yaptığını, yıktığını ya da yeniden düzenlediğini, matriksin de hücre davranışını yönettiğini yazar. Bu karşılıklılığın bir adı vardır.

Bissell, Hall ve Parry 1982'de Journal of Theoretical Biology'de yayımladıkları modelde matriksin fiziksel ve kimyasal etkilerinin hücre iskeleti ve çekirdek üzerinden gen ifadesini değiştireceğini, bunun da sırayla matriksi, matriksin de yeniden hücreyi etkileyeceğini öne sürdü. Nelson ile Bissell'in 2006 derlemesi bu modeli "dinamik karşılıklılık" adıyla anar; Spencer, Xu ve Bissell'in 2007 derlemesi de modelin işlev birimini tek başına hücre değil, hücre artı çevresi olarak tanımladığını aktarır.

Yeniden yazmanın bir yarısı yıkımdır.

Page-McCaw, Ewald ve Werb'in 2007 derlemesi ailenin ilk üyesinin 1962'de Gross ile Lapiere tarafından, başkalaşım geçiren iribaşların kuyruğunda fibriler kolajeni yıkan bir enzim olarak bulunduğunu yazar; Wikipedia'nın maddesi aynı keşfi aynı yıla ve aynı kuyruğa bağlar. İribaşın kuyruğu kurbağaya dönüşürken bir dokunun yeniden şekillenmesinin en çarpıcı örneğidir: matriks sökülmeden doku geri çekilemez. Ailenin kaç üyesi olduğu kaynaklara göre değiştiği için burada bir sayı vermiyoruz.

Sertleşen zemin hücreyi değiştirir

Döngünün öbür yarısı Oylum'un yeşil lifleridir.

Majno, Gabbiani ve arkadaşları 1971'de Science'ta deneysel olarak oluşturulmuş yara dokusundan kesilen şeritlerin düz kası kasan maddelerle kasıldığını ve bu dokudaki fibroblastların düz kasa yakın bir hücre tipine dönüşebildiğini bildirdi; Wikipedia'nın maddesi hücreyi ilk tanımlayan yayın olarak bu makaleyi gösterir. Necla Hanım'ın lamellerindeki yeşil, kurguda α-düz kas aktinine bağlanan bir antikordan geliyor.

Huang ve arkadaşları 2012'de sertliği ayarlanabilen jellerde insan akciğer fibroblastlarını büyüttü. Sertleşen zeminde aktin iplikleri çoğaldı, bir gen düzenleyici çekirdeğe geçip α-düz kas aktini geninin başına bağlandı ve hücreler miyofibroblasta dönüştü; Rho ile ilişkili kinaz yolunu engellemek bu dönüşümü durdurdu. Handorf ekibinin derlemesi de sertliğin miyofibroblast farklılaşmasını aynı yol üzerinden düzenlediğini yazar. Liu ve arkadaşlarının 2010 çalışmasında akciğer fibroblastları yumuşak zeminde şaşırtıcı ölçüde durgun kaldı; zemin sertleştikçe çoğalmaları ve matriks yapımları arttı, matriksi yıkan genlerin ifadesi ise azaldı. Yazarlar bu ilişkiyi, ilerleyici sertleşmeyi büyüten bir geri besleme olarak adlandırır.

Döngüyü koşturmak

Glikoz ile insülinin dinamiklerini işlerken negatif geri bildirim döngüsünü sapmayı geri çeken bir düzen olarak tanımlamıştık; diferansiyel denklem fikrini anlatırken de pozitif geri bildirimin sapmayı büyüttüğünü görmüştük. Burada zincir şöyle kapanır: sertlik miyofibroblastı çoğaltır, miyofibroblast daha çok kolajen yapıp çapraz bağlatır, matriks daha da sertleşir.

Döngüyü kurgu sabitlerle haftalık koşturalım. Frensiz hâlde her hafta sertlik 1,8 ile çarpılsın. 0,4 kilopaskaldan başlayan jel altıncı haftada 0,4 × 1,8⁶ ≈ 13,6, onuncu haftada 0,4 × 1,8¹⁰ ≈ 143 kilopaskala çıkar. Bu model kendiliğinden hiçbir yerde durmaz.

Üstel fonksiyon dersindeki lojistik büyüme ilk freni verir: jelin kolajeni ve hücre sayısı sınırlı olduğundan artış bir tavana, diyelim 5 kilopaskala yaklaştıkça yavaşlar. İkinci fren yıkımdır: her hafta sertliğin bir payı, kurguda 0,2'si, MMP'lerin kesimiyle geri alınır. Haftalık değişim 0,8 × E × (1 − E ÷ 5) − 0,2 × E olur. İlk hafta 0,8 × 0,4 × 0,92 ≈ 0,29 eklenir, 0,2 × 0,4 = 0,08 geri alınır; jel 0,61'e çıkar. Aynı kuralla dizi 0,92, 1,34, 1,86, 2,42 diye sürer ve Oylum'un tablosuna yakın düşer.

Artık dizi bir yerde durur. Yapım ile yıkım eşitlendiğinde 0,8 × (1 − E ÷ 5) = 0,2, yani E = 5 × (1 − 0,2 ÷ 0,8) = 3,75 kilopaskal. Engelleyicili sırada çapraz bağ olmadığından yapım payı 0,3'e düşsün: denge 5 × (1 − 0,2 ÷ 0,3) ≈ 1,7 kilopaskala iner. Yapım payı yıkımınkine eşit ya da ondan küçükse jel hiç sertleşmez. Denge noktası, döngünün iki yarısının oranından çıkar.

Döngünün kapandığı yer

Normal bir yara iyileşmesinde bu fren gerçekten çalışır. Desmoulière ve arkadaşları 1995'te yara dokusunun skara dönüşürken hücre sayısının belirgin biçimde azaldığını, özellikle miyofibroblastların ortadan kalktığını ve kapanan yarada programlı hücre ölümüne giren miyofibroblast sayısının arttığını gösterdi. Wikipedia'nın maddesi de iyileşme tamamlanınca bu hücrelerin programlı ölümle kaybolduğunu yazar.

Mekanizma düzeyinde ayrım şudur: döngünün hücre halkası söndüğünde matriks sertleşmeyi bırakır ve yıkım yavaş yavaş dengeyi geri çeker. Hücre halkası sönmediğinde yapım payı yüksek kalır, denge daha sert bir noktaya kayar. Wikipedia'nın maddesi bazı fibrotik süreçlerde bu hücrelerin kalıcı olduğunu not eder.

Sertlik tek bir sayı değil

Oylum bugünkü jele bir de atomik kuvvet mikroskobunun çok daha ince ucuyla bakıyor. Kurguda uç bir kolajen demetinin üstüne bastığında 12, iki demetin arasındaki boşluğa bastığında 0,8 kilopaskal okuyor: aynı jelde 12 ÷ 0,8 = 15 kat fark. Girinti aletinin 2,4'ü ise ucun altında kalan binlerce demetin ve boşluğun ortalamasıdır.

McKee ve arkadaşlarının 2011 derlemesi yumuşak dokular için yayımlanmış Young modülü değerlerini karşılaştırır: yöntem gözetilmediğinde aynı dokunun değerleri birkaç basamağa yayılır, girintiyle ölçülenler çekmeyle ölçülenlerden ortalamada düşük çıkar. Levental ve arkadaşlarının 2010 çalışması santimetre ölçeğindeki doku örneklerinin ticari aletlerle, nanometre ölçeğinin atomik kuvvet mikroskobuyla ölçüldüğünü, birçok dokunun ise bu ikisinin arasındaki mikrometre–milimetre ölçeğinde düzensiz olduğunu yazar; sıçan karaciğerinde ve fare meme bezinde aynı dokunun farklı noktalarının farklı sertlikte olduğunu ölçmüşlerdir. Bir doku için verilen tek sayı, hangi uçla, hangi derinlikte ve hangi yönde ölçüldüğü söylenmeden eksiktir.

Modelin sınırı

• Haftalık model sertliği tek bir değişkenle taşır. Gerçekte hücre sayısı, kolajen miktarı, çapraz bağ yoğunluğu ve yıkım enzimleri ayrı hızlarla değişir; birini ötekilerden türetmek kaba bir sadeleştirmedir.
• Yapım ve yıkım payları kurgudur ve sabit sayıldı. Liu ekibinin bulgusunda sertlik yıkım genlerini de azaltıyordu; yıkım payı sertlikle düşerse denge sabit bir nokta olmaktan çıkabilir.
• Jel, bir dokunun kan damarlarından, bağışıklık hücrelerinden ve hormonlardan yoksundur. Kültürde görülen fren, dokudaki frenlerin yalnız bir kısmını temsil eder.
• Sertlik burada tek bir modülle anlatıldı. Matriks zamanla gevşeyebilen, yüke ve hıza göre farklı yanıt veren bir malzemedir; tek sayı bu davranışı saklar.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Karaciğerde, akciğerde ya da böbrekte bağ dokusunun artıp sertleşmesi ve bazı tümörlerin çevresindeki sertleşme bu döngünün dokudaki karşılığı olarak araştırılır; sertliği görüntüleme yoluyla ölçen yöntemler de vardır, ama bu sayfa hiçbir eşiğe, tanıya ya da seyre dayanak olmaz. Dokuyu yumuşattığı, fasyayı gevşettiği ya da bağ dokusu artışını geri çevirdiği söylenen hiçbir takviye, bitki, enzim, masaj, araç ya da cihaz bu döngüden destek alamaz.

Tablonun son sütunu

Oylum defterine üç eğri çiziyor. Hücresiz sıra düz bir çizgi; hücreli sıra yükselip 3,75'in altında yataylaşan bir S; engelleyicili sıra 1,7'ye doğru ağır ağır kıvrılan bir çizgi. Eğrilerin arasına bir daire çiziyor: "sertlik → miyofibroblast → kolajen + çapraz bağ → sertlik", dairenin dışına bir ok: "MMP". Sayfanın köşesine küçük harflerle "12 ÷ 0,8 = 15" yazıyor.

Necla Hanım lamelleri kutusuna dizerken defterdeki daireye bakıyor. "Bu döngü bir dokunun işini anlatıyor," diyor. "Bazı insanlar ise tek bir dokunun her şeyi anlattığını söylüyor. Cuma o iddiayı masaya yatıracağız."

Kendini sına

1. Aynı miktarda kolajen taşıyan iki jelden biri neden ötekinden çok daha sert olabilir? En az iki etken yaz.
2. Dinamik karşılıklılık modelinde hücreden matrikse ve matriksten hücreye giden iki yolu birer örnekle anlat.
3. Kurgu modelde yapım payı 0,8, yıkım payı 0,4, tavan 5 kilopaskal olsaydı denge sertliği ne olurdu?
4. Frensiz modelde haftalık çarpan 1,5 olsaydı, 0,4 kilopaskallık jel dört hafta sonra kaç kilopaskal olurdu?
5. Yara kapanırken miyofibroblastların programlı ölümle ortadan kalkması döngünün hangi halkasını söndürür?
6. Bir doku için "sertliği 3 kilopaskal" denildiğinde hangi bilgiler eksik kalır?

Bir sonraki derse köprü

"Fasya Her Şeyi Açıklar" İddiası dersi, bu modülün kurduğu mekanik tabloyu bir iddianın karşısına koyacak: fasyanın ne olduğu anatomi kaynaklarında bile aynı sınırlarla tanımlanmıyorsa iddia hangi dokudan söz ediyor, bir dokunun mekanik olarak önemli olmasıyla bedenin her yakınmasını açıklaması arasındaki mesafe nasıl ölçülür, ve böyle bir genellemeyi hangi tasarım sınayabilir?