İntegrin Sinyali

Dört kaplamalı plaka

Kasımın ikinci pazartesisi. Bilecik'te sabah güneşi vadinin dibine geç iniyor; laboratuvarda kalorifer petekleri tıkırdıyor. Necla Hanım cuma akşamı 24 kuyucuklu bir plakanın dört sırasını ayrı ayrı kaplamış: birinci sıra kolajen, ikinci laminin, üçüncü fibronektin, dördüncü yalnız sığır serum albümini. Bu sabah fibroblastları kaplarından kaldırıp süspansiyona almış, yarısına kısa bir sentetik peptit ekleyip hepsini kırk beş dakika kuyucuklarda bekletmiş. Yıkamadan sonra geride kalan hücreler mora boyanmış.

Oylum sayımı tabloya yazıyor. Kolajende hücrelerin yüzde 70'i tutunmuş, lamininde 75'i, fibronektinde 80'i, albüminde yalnız 4'ü. Peptitli kuyucuklarda kolajen 66'da, laminin 70'te kalmış; fibronektin 12'ye düşmüş. Necla Hanım karanlık odadan ıslak bir zar getiriyor. Soldaki şeritte plakaya tutunmuş hücrelerin, sağdakinde aynı kırk beş dakikayı bir tüpte, hiçbir yüzeye değmeden geçirmiş hücrelerin proteinleri yürütülmüş. Zarın üst yarısında iki şeritte de aynı koyu bant var; alt yarısında bant yalnız soldaki şeritte. "Kinaz iki yanda da var," diyor Necla Hanım, "ama fosfatı yalnız tutunanlar taşıyor."

Bu derste ne olacak

Önce integrin ailesinin kaç parçadan kurulduğunu sayıp olası eşleşmelerin ne kadarının gerçekten var olduğunu hesaplayacağız. Peptidin neden yalnız bir sıradaki tutunmayı düşürdüğünü, bir alıcının nasıl açılıp kapandığını ve kinazı olmayan bir proteinin fosfat işaretini nasıl başlattığını izleyeceğiz.

Mekanizma

İki zincirli alıcı

Hücre Göçü dersinde odak yapışmayı tanımlarken integrini zarı geçen bir tutunma proteini olarak anmış, adını tanımsız bırakmıştık.

Campbell ile Humphries'in 2011 derlemesi omurgalılarda 18 α ve 8 β alt birimi sayar ve bunların 24 farklı alıcı kurduğunu yazar; Wikipedia'nın integrin maddesi memeliler için aynı sayıları verir. Her α her β ile eşleşebilseydi 18 × 8 = 144 dimer olurdu. Gerçekte 24 ÷ 144 ≈ 0,17 kadarı, yani altıda biri vardır. Eşleşme rastgele değildir; her α yalnız bir ya da birkaç β ile birleşir.

Hangi dimerin hangi matriksi tanıdığı da seçicidir. Campbell ile Humphries α1, α2, α10 ve α11'in β1 ile kolajen tanıyan bir alt aile kurduğunu, α3β1, α6β1, α7β1 ile α6β4'ün ise laminin alıcıları olduğunu yazar. Wikipedia'nın maddesi α1β1 ile α2β1'i kolajen ve laminine, α5β1'i fibronektine, α6β1'i laminine bağlar.

α6β4'ü Desmozomlar dersinde aktin yerine keratine bağlanan integrin olarak görmüştük; tablonun geri kalanının iç ucunda aktin vardır.

Üç harflik anahtar

Oylum'un peptidi bu seçiciliği bir yerinden keser.

Wikipedia'nın maddesi Ruoslahti ile Pierschbacher'in 1980'lerin başında bu diziyi fibronektinin hücre tutturma işi için gereken en küçük tanıma dizisi olarak bulduğunu ve bulguyu 1984'te Nature'da yayımladığını yazar. İki yazarın aynı yıl PNAS'ta çıkan makalesi de, Nature makalesini kaynak göstererek, arjinin–glisin–aspartik asit–serin dörtlüsünü hücrelerin fibronektinde tanıdığı en küçük yapı olarak tanımlar ve tek bir amino asidin benzeriyle değiştirilmesinin etkinliği ortadan kaldırabildiğini gösterir.

Barczyk, Carracedo ve Gullberg'in 2010 derlemesine göre 24 integrinden 8'i bu diziyi tanır; Campbell ile Humphries'in sıraladığı beş αV dimeri, α5β1, α8β1 ve αIIbβ3 de sekiz eder. Oran 8 ÷ 24, yani üçte birdir. Kolajen ve laminin alıcıları bu listede yer almaz.

Oylum'un tablosu bu ayrımı okur. Fibronektin sırasında peptit tutunmayı 12 ÷ 80 = 0,15'e indirmiş; kolajende oran 66 ÷ 70 ≈ 0,94, lamininde 70 ÷ 75 ≈ 0,93. Çözeltideki serbest peptit fibronektine bağlanacak cepleri doldurur ve hücre kaplamayı tutamaz; kolajen alıcıları başka bir dizi aradığından etkilenmez.

Bükük ve dik

Tanıma cebinin ne kadar hazır olduğu da değişir. Campbell ile Humphries'e göre iki alt birimin de dizine benzeyen birer kırılma yeri vardır; bükük integrin etkin değildir, dikleşmiş integrin bağlanmaya hazırdır. Bükük hâlde bağlanma cebi zara doğru bakabilir ve matriks proteininin yaklaşmasını zorlaştırır. Wikipedia'nın maddesi de bükük biçimi etkin olmayan, uzamış biçimleri etkin hâller olarak ayırır. Derleme, dikleşmeyi izleyen bir hareketle başın içindeki bağlanma yerinin düşük afiniteden yüksek afiniteye geçtiğini ekler. Bağlanmanın kalbinde bir metal iyonu durur: RGD'nin aspartatı β alt biriminin başındaki bir magnezyum iyonuna tutunur.

Afinitenin farkını Adherens Bağlantıları dersindeki doluluk hesabıyla ölçebiliriz. Kurgu birimlerle, kapalı alıcının yarı-doyma derişimi 50, açığınki 1 olsun; ortamdaki ligand 5. Kapalı alıcı zamanın 5 ÷ 55 ≈ 0,09'unda dolu, açık alıcı 5 ÷ 6 ≈ 0,83'ünde. Ligand aynıyken sabitin elli kat değişmesi alıcıyı çoğunlukla boştan çoğunlukla doluya taşır.

İçeriden açılan kapı

Açılma çoğunlukla dışarıdan değil, içeriden başlar.

Campbell ile Humphries integrin kuyruklarının kısa olduğunu, talinin bir alanının β kuyruğuna bağlanıp α ile β kuyruklarını birbirinden ayırdığını yazar; derlemeye göre arıtılmış αIIbβ3'ün zar içinde açılıp dikleşmesi için kuvvet uygulamadan talinin bağlanması yeter. Aynı derleme kindlin denen ikinci bir proteinin β kuyruğunda başka bir yere tutunduğunu belirtir. Wikipedia talinin bağlanmasının zarı geçen sarmalların açısını değiştirdiğini ve kindlin-1 ile kindlin-2'nin de integrini etkinleştirdiğini yazar. Sun, Costell ve Fässler'in 2019 perspektifi bu işbirliğini talin, kindlin ve mekanik kuvvetin integrinin afinitesini ve aviditesini birlikte düzenlemesi diye özetler.

Hücre Göçü dersinde talini debriyajın bir halkası, mekanotransdüksiyonu işlerken de gerilince açılan bir protein olarak ele almıştık. Burada aynı protein bir anahtar işi görür: kuvvet uygulanmadan önce, yalnız bağlanarak alıcıyı açar.

Afinite ve avidite

Hücre tutunmasını güçlendirmenin ikinci yolu alıcıların birbirine yaklaşmasıdır. Campbell ile Humphries sinyal komplekslerinin iki yoldan kurulduğunu yazar: alıcıların kümelenmesi etkileşimlerin aviditesini, biçim değişimi ise afinitesini artırır.

Kümeleşmenin gücü basit bir olasılıkla görülür. Kurgu bir değerle, tek bir integrin–fibronektin bağı herhangi bir anda 0,3 olasılıkla kopuk olsun. Hücreyi tek bağ tutuyorsa yüzeyden ayrılma olasılığı 0,3'tür. On bağlık bir kümede hepsinin aynı anda kopuk olması gerekir: bağlar birbirinden bağımsızsa 0,3¹⁰ ≈ 0,000006. Kopan bağ, komşuları yerini tutarken yeniden kurulabilir; tek bağın gücü hiç değişmeden kümenin yüzeyden ayrılma olasılığı milyonda altıya iner.

Kinazsız bir alıcının sinyali

Reseptörü, zarın bütünlüğünü sinyalle birlikte işlediğimiz derste dış sinyali içeri aktaran protein olarak tanımlamıştık. OpenStax'in biyoloji kitabı bazı reseptörlerin iç alanının kendisinin bir enzim olduğunu yazar: tirozin kinaz reseptörleri sinyal gelince iki kopya hâlinde birleşir ve iç alanlarındaki tirozinlere fosfat eklenir. İntegrin bu türden değildir. Campbell ile Humphries integrinlerin enzim etkinliği taşımadığını, sinyalin sinyal komplekslerinin kurulmasıyla üretildiğini yazar; Wikipedia da integrinin kendi kinaz etkinliği olmadığını, sinyali odak yapışma kinazı ve Src ailesi kinazlarıyla ilettiğini belirtir.

Huveneers ile Danen'in 2009 derlemesine göre integrin ligandına bağlanınca FAK 397 numaralı tirozininde kendi kendini fosforlar ve bu fosfat Src kinazının SH2 adlı alanına bir yuva açar. Src de FAK'ın başka tirozinlerini fosforlayıp etkinliğini artırır. Toutant ekibinin 2000 çalışması 397. tirozini FAK'ın etkinleşmesi için kritik kalıntı olarak adlandırır. Aynı derleme FAK–Src çiftinin iskele proteini paksilini fosforladığını, işaretin buradan Rho ailesinin küçük GTPazlarına ve ERK adlı MAP kinazına uzandığını aktarır. Necla Hanım'ın zarındaki alt bant, fosforlanmış 397. tirozini tanıyan bir antikorun izi olarak kurgulandı: FAK tüpteki hücrelerde de vardı, ama tirozinine fosfat yalnız tutunanlarda eklenmişti.

Tutunmaya bağlı yaşam

Sinyalin en keskin sonucu hücrenin hayatta kalıp kalmamasıdır.

Frisch ile Francis 1994'te Journal of Cell Biology'de epitel hücrelerinin matriksle etkileşimi bozulunca programlı ölüme girdiğini bildirdi ve olguya bu adı verdi; Wikipedia'nın maddesi terimi aynı yayına bağlar. Frisch, Vuori, Ruoslahti ve Chan-Hui'nin 1996 çalışmasının özeti integrinlerin matriks proteinleriyle etkileşiminin FAK'ı etkinleştirdiğini ve anoikisi baskıladığını, sürekli etkin bir FAK'ın epitel hücrelerini bu ölümden kurtardığını yazar. Oylum'un tüpte bekleyen hücreleri kırk beş dakikada ölmedi; fosfatın yokluğu yalnız ölüm yolunu açık bırakan ilk işarettir.

Modelin sınırı

• Bükük ile dik arasındaki ayrım bir sadeleştirmedir. Wikipedia'nın maddesi yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu yapılarında matriks ligandına bağlı integrinlerde de bükük biçimin baskın görülebildiğini not eder.
• Doluluk ve kopma hesapları kurgu sabitlerle yapıldı ve kümedeki bağları bağımsız saydı. Gerçek kümelerde bağlar kuvveti paylaşır; birinin kopması komşularının yükünü artırır.
• Tablo bir dimere tek bir ligand yazar. Aynı dimer birden çok matriks proteinini, aynı protein birden çok dimeri tanıyabilir; hangi RGD alıcılarının sayılacağı kaynağa göre biraz değişir.
• Sinyal zinciri doğrusal bir çizgiyle anlatıldı. Huveneers ile Danen integrin sinyalinin Src, FAK ve Rho GTPazları arasında karşılıklı etkileşen bir ağ olduğunu vurgular.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Bazı integrinler ilaç geliştirmede hedef olmuştur; bu ders onları ele almaz. Hücre sinyalini düzenlediği, hücre tutunmasını güçlendirdiği ya da kök hücreleri harekete geçirip dokuyu yenilediği söylenen hiçbir takviye, peptit, krem ya da cihaz bu zincirden dayanak alamaz.

Zarın alt yarısı

Oylum defterine iki çubuk çiziyor: biri dizinden kırılmış, öbürü dimdik. Kırık olanın yanına "talin gelmeden: 0,09", dik olanın yanına "talin geldi: 0,83" yazıyor. Altına "144 → 24", "RGD: 8/24", "0,3¹⁰" notlarını düşüyor. En alta zarın iki şeridini çizip soldakinin altına küçük bir "P" koyuyor.

Necla Hanım plakanın kapağını kapatırken kolajen sırasını gösteriyor. "Bu hücreler kaplamaya tutunmakla kalmıyor, her gün onu biraz değiştiriyor," diyor. "Çarşamba haftalardır bekleyen jellerin ne kadar sertleştiğine bakacağız."

Kendini sına

1. 18 α ve 8 β alt birimi rastgele eşleşseydi kaç dimer olurdu? 24 gerçek dimer bu sayının yüzde kaçıdır?
2. Oylum'un tablosunda peptit fibronektin sırasındaki tutunmayı düşürüp kolajen sırasını neredeyse değiştirmedi. Bu fark alıcıların hangi özelliğinden gelir?
3. Kurgu yarı-doyma sabiti kapalı hâlde 50, açık hâlde 1 iken ligand 10 birime çıkarsa iki hâlin doluluğu ne olur?
4. Tek bağın bir anda kopuk olma olasılığı 0,2 ise beş bağlık bir kümenin tümüyle kopuk olma olasılığı nedir? Bu hesabın hangi varsayımı gerçek kümede bozulur?
5. Tirozin kinaz reseptörü ile integrin, sinyali fosfata çevirme biçiminde nasıl ayrılır?
6. Süspansiyonda tutulan hücrelerde fosforlanmış FAK bandının görülmemesi anoikis açısından ne anlama gelir?

Bir sonraki derse köprü

Doku Sertliği ve Hücre Davranışı dersi tek hücrenin zemini yoklamasından dokunun ölçeğine çıkacak: organların sertliği neden bu denli ayrışır, hücrenin matriksi salgılayıp çapraz bağlayarak yeniden şekillendirmesi dokuyu nasıl sertleştirir, ve sertleşen matriks aynı hücrelerin davranışını değiştirdiğinde hücre ile matriks arasındaki bu karşılıklı döngü nerede dengeye oturur?