Gap Junctionlar

Cam iğnede iki renk

Kasımın ilk pazartesisi. Bilecik'te sis dağılmış, vadinin karşı yamacındaki kavaklar görünüyor. Necla Hanım floresan mikroskobunun yanına ince bir cam iğne takılmış bir kol yerleştirmiş; iğnenin ucu bir mikrometreden de ince. Cam tabanlı kapta birbirine sıkıca dayanmış tek katlı epitel hücreleri var. İğnenin içinde iki boya karışık: sarı-yeşil ışıyan küçük bir molekül olan Lucifer yellow ve kırmızı ışıyan, çok daha iri bir şeker zinciri, dekstran.

Oylum ekranda tek bir hücre seçiyor, Necla Hanım iğneyi o hücreye batırıp küçük bir basınç veriyor. Hücre iki renkle birden parlıyor. İlk dakikanın sonunda sarı renk hücrenin sınırlarını aşıyor ve çevresindeki altı komşu solgun bir halkayla yanıyor. İkinci dakikada onların ötesinde on bir hücre daha, daha soluk. Kırmızı ise yerinden kıpırdamıyor; enjekte edilen hücre ekranda kırmızı bir ada gibi kalıyor.

"Sarı bir hücreden ötekine nasıl geçiyor?" diyor Oylum. "Dışarı çıkıp komşuya yeniden mi giriyor?" Necla Hanım ikinci kabı gösteriyor. "Bu kabı yarım saattir bir kanal kapatıcıyla beklettim. Aynı iğneyle burada da dene."

Bu derste ne olacak

Adındaki "boşluğun" gerçekte ne olduğunu ölçüp dersin konusu olan kanalın proteinden nasıl kurulduğunu göreceğiz. Sarı boyanın geçip kırmızının geçemediği eşiği, sıkı bağlantının gözeneğiyle karşılaştıracağız. Sonra kanal sayısından iki hücre arasındaki iletkenliği hesaplayıp kalp kası hücrelerinin neden birlikte kasıldığını ve kanalların hangi koşulda kapandığını konuşacağız.

Metin

Adın söylediği ve söylemediği

Dokuyu ve hücreler arası bağlantıları tanıttığımız derste bu yapıya oluklu bağlantı demiş, iletişim kuran bağlantılar öbeğine koymuş, altı konneksinin bir konnekson kurduğunu ve kalp kası hücrelerinin bu sayede birlikte kasıldığını bir paragrafta geçmiştik. İngilizce adı gap junction, yani aralık bağlantısıdır. Goodenough ile Paul'ün 2009 derlemesi adın kaynağını anlatır: iki konneksonun uç uca kenetlenmesi için zarlar birbirine çok yaklaşır ve arada yaklaşık 2 nanometrelik dar bir hücre dışı aralık kalır. Wikipedia'nın maddesi bu aralığı 2–4 nanometre olarak verir.

Perşembe günü desmozomun zarlarını yaklaşık 30 nanometrelik bir aralığın ayırdığını görmüştük. Burada aralık onda bir kadardır; zarlar hemen hemen birbirine değer ve iki hücrenin sitoplazması arasında kısa bir tünel açılır.

On iki konneksin, bir kanal

Konneksinin dört zar geçişini hem Wikipedia'nın konneksin maddesi hem de Jagielnicki ile arkadaşlarının 2024 yapı derlemesi verir; 21 gen sayısında da iki kaynak birleşir, Goodenough ile Paul de "21 üyeli aile" der.

Doku dersinde konneksonu kısaca "kanal" diye anmıştık; tam kanal için iki konnekson gerekir. Altı konneksin, her biri dört sarmal: 6 × 4 = 24 zar geçen sarmal bir yarım kanalı kurar; Jagielnicki ekibi de bu sayıyı verir. Tam kanalda on iki konneksin ve kırk sekiz sarmal bulunur. İki yarım kanal aynı konneksinden kuruluysa kanala homotipik, farklı konneksinlerden kuruluysa heterotipik denir; Goodenough ile Paul her eşleşmenin mümkün olmadığını yazar. Elfgang ve arkadaşlarının 1995 çalışmasında Cx40 taşıyan hücreler Cx43 taşıyanlarla boya alışverişi yapamadı.

Kanallar tek tek dağılmaz. Wikipedia'nın maddesi onlarca ile binlerce kanalın bir araya kümelendiği bölgeye oluklu bağlantı plağı adını verir; Jagielnicki ekibi plağı neredeyse altıgen düzende sıkı dizilmiş kanallar olarak tarif eder. Plak kalıcı da değildir. Wikipedia konneksinlerin yarı ömrünü birkaç saat olarak verir; Rodríguez-Sinovas ve arkadaşlarının 2021 derlemesi Cx43 için 1,5 ile 5 saat arası yazar. Omurgasızlarda aynı işi inneksin denen başka bir protein ailesi görür; Goodenough ile Paul de Jagielnicki ekibi de bunu belirtir.

Gözeneğin eşiği

Jagielnicki ekibi tam kanalın gözeneğini yaklaşık 15 ångström, yani 1,5 nanometre olarak verir ve molekül boyutu için genel kural olarak 12–15 ångströmlük bir sınır aktarır. Wikipedia'nın maddesi yaklaşık 8 ile 20 ångström arası bir aralık verir. Sıkı Bağlantılar dersinde klaudinlerin açtığı por yolunun yarıçapı yaklaşık 4 ångström, yani çapı 8 ångström kadardı. 15 ÷ 8 ≈ 1,9: oluklu bağlantının gözeneği, epiteli hücrelerin arasından geçen en dar yolun iki katına yakın genişliktedir.

Eşiği kütleyle söylemek daha kolaydır, ama kaynaklar tek bir sayıda birleşmez. Jagielnicki ekibi giriş cümlesinde yaklaşık 1 kilodalton, genel kural olarak 0,6 kilodalton yazar; Dhein ile Salameh'in 2021 derlemesi 1000 dalton, Rodríguez-Sinovas ekibi 1,5 kilodaltonun altı der, Wikipedia ise omurgalı kanalları için 485 dalton verir. Sınırın bu kadar yayılmasının bir nedeni, molekülün yalnız kütlesinin değil biçiminin ve yükünün de önemli olması; öteki nedeni konneksin türüdür. Rodríguez-Sinovas ekibi, küçük moleküller için kanalın pek seçici olmadığını, molekül büyüdükçe seçiciliğin belirginleştiğini yazar.

Oylum'un sarı boyası bu eşiğin altında kalır. Wikipedia Lucifer yellow'un dilityum tuzu için 444, PubChem karbohidrazit tuzu için 457 dalton verir; yaklaşık 450 dalton, 1 kilodaltonluk eşiğin 450 ÷ 1000 = 0,45'i eder. Kırmızı dekstran 10 kilodaltonluktur, eşiğin on katı; bir konneksinin kendisi bile 43 kilodaltondur. Elfgang ekibi Lucifer yellow'un inceledikleri bütün konneksin kanallarından geçtiğini bulmuş, iki hücre topluluğunu birbirinden ayırmak için de birini önceden dekstranla işaretlemişti; bu işaret ancak dekstran komşuya geçmediği için işe yarar.

Neler geçer? Rodríguez-Sinovas ekibi su, sodyum, potasyum, klorür ve kalsiyum iyonları, IP₃, ATP, ADP, cAMP ve glukozu sayar. Jagielnicki ekibi potasyumdan ATP'ye kadar birçok iyon ve metaboliti anar, Wikipedia IP₃'ü ve kalsiyumu. Zar Bütünlüğü ve Hücresel Sinyal dersinde IP₃'ün bir alıcının uyarısıyla zarda üretilip sitozole yayıldığını görmüştük; oluklu bağlantı aynı haberciye komşu hücreye geçecek bir yol açar. Proteinler ve nükleik asitler geçmez.

Kanaldan geçen akım

Kanal molekül taşıdığı gibi iyon da taşır, iyon hareketi de akım demektir. Dhein ile Salameh iki hücre arasındaki iletkenliği üç sayının çarpımı olarak yazar: kanal sayısı, tek bir kanalın iletkenliği ve açık kalma olasılığı. Kanal Aracılı Taşınım dersinde tek bir potasyum kanalının açık kalma olasılığını ve 30 pikosiemenslik kurgu iletkenliğini kullanmıştık. Oluklu bağlantı kanalı daha geniştir. Rodríguez-Sinovas ekibi Cx43 kanalı için en yüksek tek kanal iletkenliğini 110 pikosiemens olarak verir; Dhein ile Salameh de Cx43'te 100 pikosiemenslik kanal olaylarını aktarır.

Kurgu bir plakta 2000 kanal olsun. İki derleme de Bukauskas ekibinin 2000 yılındaki ölçümünü aktarır: büyük plaklarda bile kanalların yalnız yüzde 10–20'si işlevseldir. Yüzde 15 alırsak 2000 × 0,15 = 300 açık kanal kalır. İletkenlik 300 × 100 pikosiemens = 30 nanosiemens, direnç 1 ÷ (30 × 10⁻⁹) ≈ 33 megaohm eder. İki hücrenin gerilimi arasında 10 milivoltluk fark varsa akım 30 × 10⁻⁹ × 0,010 = 3 × 10⁻¹⁰ amper olur. Tek yüklü iyonlarla bu, 3 × 10⁻¹⁰ ÷ 1,602 × 10⁻¹⁹ ≈ 1,9 × 10⁹ yük demektir, her saniye. Kapılı potasyum kanalı için hesapladığımız 1,5 pikoamperin iki yüz katı.

Bu akımı Sıkı Bağlantılar dersindeki çubuklu elektrot görmez. Elektrot akımı tabakanın üstünden altına geçirir; oluklu bağlantının açtığı yol ise hücreden hücreye, tabakanın düzleminde uzanır ve iyon hücre dışına hiç çıkmaz. Transepitelyal direnç, paraselüler ve transselüler iki koldan oluşan bir devreydi; oluklu bağlantı bu devreye üçüncü bir kol eklemez, hücrelerin iç ortamını birbirine bağlar.

Goodenough ile Paul, bu bağlantıların ilk kez kalp kasında ve sinir dokusunda, komşu hücreler arasında elektrik ilettikleri için keşfedildiğini yazar ve 1952'deki Weidmann ölçümünü anar; Rodríguez-Sinovas ekibi de Weidmann'ın kalbin ileti liflerinde tek bir hücreye verilen akımın o hücrenin sınırlarının ötesine yayıldığını gösterdiğini aktarır. Desmozomlar dersinde kalp kası hücrelerini uç uca bağlayan interkalar diskte desmozom ve adherens tipi bağlantının yanında oluklu bağlantının da bulunduğunu görmüştük. Perçinler hücreleri mekanik olarak tutarken bu kanallar birinin uyarımını ötekine aktarır; Dhein ile Salameh kalbin bu yüzden tek bir büyük hücre gibi, bir sinsityum gibi çalıştığını yazar.

Kapanan kapılar

Oylum ikinci kaba enjeksiyon yapıyor. Sarı enjekte edilen hücrede kalıyor; iki dakika sonra altı komşudan yalnız birinde zor seçilen bir parlaklık var.

Kanal Aracılı Taşınım dersinde kapılı kanalları tanımıştık. Oluklu bağlantı da kapılıdır. Dhein ile Salameh kanal iletkenliğinin başlıca düzenleyicilerini hücre içi pH, hücre içi kalsiyum ve iki hücre arasındaki gerilim farkı olarak sayar. Hücre içi asitlenince konneksinin bir ucu kıvrılıp gözeneği tıkar; derlemeler buna top ve zincir düzeneği der. Jagielnicki ekibi Cx26 kanalında on iki kalsiyum iyonunun bağlanmasıyla katyon geçişini elektrostatik olarak engelleyen bir kapıyı da anlatır.

Bu kapıların bir anlamı var. Hasar gören bir hücrede pH düşer, kalsiyum yükselir. Dhein ile Salameh kalp dokusu kan akımından yoksun kaldığında kanalların hızla kapandığını ve hücrelerin ATP kaybının bu yolla sınırlandığını yazar; Rodríguez-Sinovas ekibi de bu kapanmanın hasarlı dokuyu elektrik bakımından ayırdığını aktarır. Kanal açıkken komşuyu besleyen yol, kapanınca sağlam hücreyi zarar görenden korur.

Kurgu plakta işlevsel kanalların onda biri açık kalsaydı iletkenlik 3 nanosiemense düşer, direnç yaklaşık 333 megaohma çıkardı. Konneksin genlerindeki bazı değişikliklerin kalıtsal işitme kaybıyla, bazı deri ve sinir hastalıklarıyla ve kalp ritim bozukluklarıyla ilişkili olduğu bilinir; bu ders o hastalıkların hiçbirini tanımlamaz, açıklamaz da.

Komşu odadan gelen kap

Öğleye doğru yan laboratuvardan bir araştırmacı kapıyı tıklatıyor, elinde kalp kası hücresi kültürü olan küçük bir kap. Oylum objektifi değiştiriyor. Birbirine değen hücreler aynı anda büzülüp gevşiyor; ekranda tek tek hücre değil, tek bir tabaka nefes alıyor gibi.

Oylum defterine altı ve on bir sarı nokta, ortada kırmızı bir daire çiziyor. Yanına "0,45 kDa geçer, 10 kDa geçmez", "300 × 100 pS = 30 nS", "kapatıcı → ada" yazıyor. Altına ekliyor: "Tabaka yan yana bağlandı. Peki neyin üstünde duruyor?" Necla Hanım kabı inkübatöre kaldırırken sayfaya bakıyor. "Hücrelerin birbirine nasıl bağlandığı bitti," diyor. "Çarşamba altlarındaki ince katmana bakacağız."

Kendini sına

1. Desmozomdaki 30 nanometrelik aralık ile oluklu bağlantıdaki yaklaşık 3 nanometrelik aralık kaç kat farklıdır? Bu fark kanalların kurulabilmesi için neden gereklidir?
2. 1500 kanallı bir plakta işlevsel kanalların yüzde 20'si açık ve her birinin iletkenliği 100 pikosiemens ise iki hücre arasındaki iletkenlik ve direnç kaçtır?
3. İğneye 3 kilodaltonluk bir dekstran konsaydı komşu hücrelerde ne görmeyi beklerdin? Kaynakların verdiği sınır aralığına göre yanıtın ne kadar kesin olurdu?
4. Transepitelyal direnç ölçümü bir tabakadaki oluklu bağlantıları neden görmez?
5. Hücre içi pH'ı düşürülmüş bir tabakada sarı boya enjeksiyonunun sonucu için ne öngörürdün, hangi düzeneğe dayanarak?
6. Homotipik ve heterotipik kanal arasındaki fark nedir? Cx40 taşıyan bir hücre ile Cx43 taşıyan bir hücre arasında boya aktarımı bekler miydin?

Bir sonraki derse köprü

Bazal Membran dersi, hücrelerin birbirine değil altlarındaki zemine bakacak: epitelin üstüne oturduğu, hücre dışında kalan o ince tabaka hangi ağlardan örülür, tip IV kolajenin kurduğu ağ ile laminin bu tabakada nasıl birleşir, ve Desmozomlar dersinde hemidesmozomun dışarıda tutunduğu laminin-332 bu tabakanın neresinde durur?