Sıkı Bağlantılar

Asılı kaplar ve çubuklu elektrot

Ekimin son pazartesisi, Bilecik'te sabah sisi vadiden geç kalkıyor. Bir üniversitenin epitel ve bağ dokusu kültür laboratuvarında Necla Hanım inkübatörden on iki kuyucuklu bir plaka çıkarıyor. Her kuyucuğun içinde, kenarından asılı, dibi gözenekli ince bir zardan yapılmış küçük bir kap duruyor. Altı gün önce bu zarların üstüne epitel hücreleri ekilmiş; hücreler çoğalıp zarı tek katman hâlinde örtmüş. Kabın içi üst bölme, kuyucuğun kalanı alt bölme.

Bu ay araştırma görevlisi olarak başlayan Oylum, ucunda iki ince çubuk bulunan bir elektrotu eline alıyor: kısa çubuk kabın içine, uzun çubuk dışarıdaki kuyucuğa giriyor. Ekranda 720 ohm beliriyor. Hücresiz boş bir kapta aynı ölçüm 120 ohm vermiş. "İkinci gün 230'du, dördüncü gün 480," diyor Oylum. "Hücreler dört günde üç kat çoğalmadı ki. Direnç neden hâlâ artıyor?" Necla Hanım plakayı ışığa tutuyor. "Çünkü ölçtüğün şey hücrelerin sayısı değil. Hücrelerin arasında kalan aralıktan akımın ne kadar zor geçtiği."

Bu derste ne olacak

Epitelin tepesindeki bağlantı şeridini tanıyacak, bir maddenin tabakayı hangi iki yoldan aşabileceğini ayıracak ve Oylum'un ekranındaki ohmları dokuya ait bir sayıya çevireceğiz. Sonra iyonların ve büyük moleküllerin bağlantıdan geçtiği ayrı yolları, en son da bağlantının zarın kendisi üstündeki ikinci işini konuşacağız.

Metin

Tepedeki şerit

Tek hücreden çok hücreli organizmaya geçtiğimiz derste sıkı bağlantıyı bir kapatıcı bağlantı olarak tanımış, klaudin ve okludin adlarını anmış, bağlantının bir de çit gibi çalıştığını not etmiştik. İnsan hücresinin görsel haritasında ise epitel hücresinin boşluğa bakan tepe yüzünü ve komşularına ile tabana bakan taban-yan yüzünü ayırmıştık. Sıkı bağlantı bu iki yüzün sınırında, hücrenin yan yüzünü en tepede bir kuşak gibi dolanır.

Anderson ile Van Itallie'nin 2009 derlemesi ve Shen ile arkadaşlarının 2011 derlemesi, bağlantının elektron mikroskobunda ilk kez 1963'te Farquhar ile Palade tarafından görüldüğünü yazar. Farquhar ile Palade, epitel hücrelerini birbirine bağlayan yapıyı yukarıdan aşağıya üç ayrı temasa ayırdı: en tepede kapatan bağlantı (zonula occludens), altında kadherine dayanan yapışma bağlantısı, daha aşağıda desmozomlar. Kapatan bağlantının bulunduğu yerde komşu iki hücrenin zarları arasındaki aralık neredeyse ortadan kalkar.

Kesitte bu temas birkaç noktada zarların birbirine değmesi olarak görünür; Anderson ile Van Itallie bu noktaları "öpüşme" diye anar ve sayılarının dokuya göre tek bir temastan onlarcasına değiştiğini yazar. Zarı iki yaprağı arasından yaran dondurma-kırma yöntemi aynı yapıyı yukarıdan gösterir: birbirine kavuşan, dallanan iplikçiklerden bir ağ. Üç derleme de bu ağı klaudinlerden kurulu iplikçikler olarak yorumlar. Kesitteki her öpüşme noktası, ağın bir iplikçiğinin kesilmiş yeridir.

Ağı kuran proteinler

Klaudinler zarı dört kez geçen proteinlerdir; hücre dışındaki halkaları komşu hücrenin klaudinleriyle buluşarak aralığı kapatır. Wikipedia'nın klaudin maddesi ve Günzel ile Yu'nun 2013 derlemesi adı ilk kez 1998'de Furuse ile Tsukita'nın koyduğunu yazar. Ailenin üye sayısı kaynağa göre değişir; iki kaynak da memelilerde yirmiyi aşkın klaudin geni sayar. Okludin de zarı dört kez geçer ve aynı iplikçiklerde bulunur.

Zarın iç yüzünde bu proteinleri bir arada tutan iskele proteinleri durur. Anderson ile Van Itallie klaudinlerin hücre içindeki ucunun ZO-1, ZO-2 ve ZO-3'teki bağlanma bölgelerine oturduğunu yazar; Wikipedia'nın ZO-1 maddesi bu proteini zar proteinlerini aktin iskeletine bağlayan bir köprü olarak tarif eder. Hücre iskeleti derslerinde zarın altında gördüğümüz aktin ağı, bağlantının iç yüzden tutunduğu yerdir.

İki yol

Zar taşınımı modülünde incelediğimiz kanallar, taşıyıcılar ve pompalar transselüler yolun parçalarıdır. Ozmoz ve tonisite dersinde suyun epitelde hücrenin içinden mi, hücrelerin arasından mı geçtiğini açık bırakmıştık; ikinci yolun kapısı burada, sıkı bağlantının kendisidir.

Transselüler yolda madde iki zarı arka arkaya geçer. Paraselüler yolda ise tek engel bağlantının iplikçik ağıdır. Bir epitelin ne kadar geçirgen olduğunu çoğu zaman bu ağ belirler.

Ohmdan dokuya

Oylum'un altıncı gün okuması 720 ohm, boş kabınki 120 ohm. Tabakaya ait direnç 720 − 120 = 600 ohm. Kurgu olarak kabın zar alanı 1,1 santimetrekare olsun: 600 × 1,1 = 660 Ω·cm². Aynı hesap ikinci gün için (230 − 120) × 1,1 ≈ 121, dördüncü gün için (480 − 120) × 1,1 ≈ 396 Ω·cm² verir.

Alanla neden bölmüyor da çarpıyoruz? Srinivasan ile arkadaşlarının yöntem derlemesi, direncin zar alanıyla ters orantılı olduğunu yazar. Alan büyüdükçe akımın geçebileceği aralık da uzar, direnç düşer. Aynı tabaka 0,55 santimetrekarelik bir kapta büyüseydi ekran 660 ÷ 0,55 = 1.200 ohm gösterirdi. Alanla çarpılmış değer iki kabı karşılaştırılabilir kılar. Tersi de işe yarar: 1 ÷ 660 ≈ 0,0015, santimetrekare başına yaklaşık 1,5 milisiemenslik bir iletkenlik.

Ohm yasası dersinde paralel bağlı dirençlerin eşdeğerini, tek tek dirençlerin terslerini toplayarak bulmuştuk. Srinivasan ile arkadaşları tabakayı tam böyle bir devre olarak çizer: paraselüler direnç ile hücre zarlarından geçen yol paralel iki koldur. Hücre yolunun direnci kurgu olarak 5.000 Ω·cm² olsun. O zaman 1 ÷ 660 = 1 ÷ 5.000 + 1 ÷ Rₚ, buradan paraselüler direnç Rₚ ≈ 760 Ω·cm² çıkar. İletkenliklerin oranı akımın yaklaşık yüzde 87'sinin hücrelerin arasından geçtiğini söyler. Anderson ile Van Itallie de aynı sonuca varır: hücre zarlarının direnci genellikle çok yüksek olduğu için, bir epitelin direncinin yüksek mi düşük mü olacağına sıkı bağlantı karar verir.

Sızdıran ve sıkı epitel

Dokular arasında fark çok büyüktür. Anderson ile Van Itallie memeli böbreğinde süzüntünün geçtiği ilk kanal kesimi olan proksimal tübül için yaklaşık 6 Ω·cm², kara kurbağasının idrar kesesi için 300.000 Ω·cm² verir. Günzel ile Yu memeli idrar kesesini en sıkı epitel sayar ve direncini 75.000'den 100.000 Ω·cm²'nin üstüne kadar verir. Oylum'un 660'ı bu iki uç arasında bir yerdedir. Direnci düşük epitellere sızdıran, yüksek olanlara sıkı epitel denir.

"Sızdıran" sözcüğü burada bir kusuru anlatmaz. Günzel ile Yu düşük direncin kusurlu bir bağlantı demek olmadığını vurgular; belirli iyonlara iletkenlik, bağlantı iplikçiklerinin yapısında bulunan bir özellik olabilir. Aynı derleme proksimal tübülde sodyum, klorür ve kalsiyum gibi iyonların en azından bir kısmının hücrelerin arasından geri emildiğini yazar. Fonksiyonel tıp yazınında sık geçen "sızdıran bağırsak" adı bu mekanizmayı ödünç alır; ama bir epitelin geçirgen olabilmesi, o adla anılan bir sendromun varlığını kanıtlamaz, herhangi bir ürünün etkisine de kanıt olmaz.

Kapının seçtikleri

Klaudinler aralığı yalnız kapatmaz, bazıları orada dar gözenekler de açar. Günzel ile Yu klaudin-2'nin katyonlara ve suya geçirgen, yüksek iletkenlikli bir gözenek kurduğunu yazar; Anderson ile Van Itallie de klaudin-2'nin sıkı bir tabakayı daha sızdıran yaptığını ve 4 ångströmden küçük maddelerin geçişini seçici olarak artırdığını belirtir. Günzel ile Yu klaudin-1'i ise tabakanın direncini artıran bir bariyer klaudini olarak anlatır. Bir epitelin hangi iyonu seçtiği, hangi klaudinleri taşıdığına bağlıdır.

Shen ile arkadaşları iki yolun ölçümünü de ayırır: elektrik direnci bütün iyonların akısını ölçer ve çoğunlukla por yolunu yansıtır; sızıntı yolunu görmek için büyük bir iz maddenin tabakadan geçişini doğrudan ölçmek gerekir. Klaudin-2 eklenmiş bir tabakada direnç düşebilir, büyük iz maddenin geçişi ise değişmeyebilir.

Boyanın alt bölmeye geçişi

Oylum öğleye doğru üst bölmeye büyük, floresanla işaretlenmiş bir şeker zinciri (dekstran) ekliyor: kurgu olarak litrede 100 mikromol. Bir saat sonra 1,5 mililitrelik alt bölmede litrede 0,05 mikromol ölçüyor. Alt bölmeye geçen madde 0,05 × 10⁻⁶ × 1,5 × 10⁻³ = 7,5 × 10⁻¹¹ mol, saniyede 7,5 × 10⁻¹¹ ÷ 3.600 ≈ 2,1 × 10⁻¹⁴ mol eder.

Geçirgenlik katsayısı, Basit Difüzyon dersindeki tanımıyla, bir zardan geçen akının iki yan arasındaki derişim farkına bölümüydü. Aynı oranı tabaka için kurarsak P, saniyedeki geçişin alan ile üst bölmedeki başlangıç derişiminin çarpımına bölümüdür. Litrede 100 mikromol, santimetreküpte 10⁻⁷ mol eder: P = 2,1 × 10⁻¹⁴ ÷ (1,1 × 10⁻⁷) ≈ 1,9 × 10⁻⁷ santimetre/saniye. Hesabın bir varsayımı var: alt bölmedeki derişim üsttekinin binde birinin bile altında kaldığı için geri akış sayılmadı.

İkinci plakada Necla Hanım bir saat önce besiyerindeki kalsiyumu bağlayıp ortamdan çekmiş. Aynı ölçümlerde direnç 90 Ω·cm²'ye düşmüş, alt bölmede litrede 0,60 mikromol boya birikmiş. Direnç 660 ÷ 90 ≈ 7,3 kat azalmış, geçirgenlik katsayısı ise 0,60 ÷ 0,05 = 12 katına çıkıp yaklaşık 2,3 × 10⁻⁶ santimetre/saniye olmuş. Gonzalez-Mariscal ile arkadaşlarının 1990 çalışması ve Zheng ile Cantley'nin 2007 çalışması bu "kalsiyum anahtarını" aynı biçimde anlatır: kalsiyum çekilince bağlantılar dağılır, kalsiyum geri verilince yeniden kurulur ve direnç yükselir.

Çit

Sıkı bağlantının ikinci işi aralıkla değil zarın kendisiyle ilgilidir. İkincil aktif taşıma dersinde sodyumla şekeri birlikte içeri alan taşıyıcının tepe yüzde, sodyumu dışarı atan pompanın taban-yan yüzde durduğunu görmüştük. Zar akışkandır; proteinler ve lipitler zarın düzleminde yanal olarak kayabilir. Sıkı bağlantı bu kaymayı iki yüzün sınırında durdurur ve hücrenin kutupluluğu korunur. Günzel ile Yu çit işinin kapı işinden mekanizma bakımından bağımsız olduğunu yazar: aralığı geçirgenleştiren bir değişiklik iki yüzün bileşimini karıştırmayabilir.

İnkübatörün kapağı kapanınca

Oylum defterine üç satır yazıyor: "660 → 90", "P × 12", "direnç ≈ por, boya ≈ sızıntı". Altına bir soru ekliyor: "Kalsiyum sıkı bağlantının kendi proteinine mi lazım?"

Necla Hanım ikinci plakanın besiyerini kalsiyumlu olanla değiştirip inkübatöre geri koyuyor. "Kalsiyumu asıl isteyen belki şeridin kendisi değil, hemen altındaki kuşak," diyor. "Yarın sabah direnç yeniden tırmanıyorsa, önce o kuşağa bakacağız."

Kendini sına

1. Boş kabın direnci 110 ohm, hücreli kabınki 550 ohm, zar alanı 0,33 santimetrekare. Tabakanın direnci kaç Ω·cm²? Aynı tabaka 1,1 santimetrekarelik bir kapta büyüseydi, boş kabın payı çıkarıldıktan sonra tabakaya kaç ohm kalırdı?
2. Hücre yolunun direnci 8.000, tabakanın toplam direnci 400 Ω·cm² olsun. Paraselüler direnç kaçtır, akımın yüzde kaçı hücrelerin arasından geçer?
3. Bir tabakaya klaudin-2 eklendikten sonra direnç yarıya iniyor, büyük dekstranın geçirgenlik katsayısı değişmiyor. Bu sonuç hangi yolun değiştiğini gösterir?
4. Alt bölmede biriken boya üst bölmedekinin yarısına ulaşsaydı geçirgenlik katsayısı hesabındaki hangi varsayım bozulurdu?
5. Proksimal tübülün birkaç Ω·cm²'lik direnci neden bir bozukluk sayılmaz?
6. Sıkı bağlantının çit işi ortadan kalksa ama kapı işi sürse, tepe yüzde duran bir taşıyıcı için ne beklerdin?

Bir sonraki derse köprü

Necla Hanım'ın sözünü ettiği kuşak yapışma bağlantısıdır. Adherens Bağlantıları dersi soracak: kadherin denen proteinler iki hücreyi birbirine kalsiyumla nasıl tutturur, katenin adlı bağlayıcılar bu tutunmayı hücrenin içindeki aktin kuşağına nasıl aktarır, ve kalsiyum çekildiğinde üstteki sıkı bağlantının da açılması bu kuşağın dağılmasıyla mı ilgilidir?