Ekzositoz

Kenarda yanan kıvılcımlar

Gece esen rüzgâr bodrum penceresinin önüne kuru çınar yapraklarını yığmış; cuma sabahının gökyüzü açık ve soğuk. Selvi Hanım çarşambadan beri rafta bekleyen, salgı keseli hücrelerle kalsiyumlu tamponun durduğu şişeyi tezgâha koyuyor. Bu hücrelerin keseciklerine asitte sönük kalan, nötr ortamda parlayan bir floresan işaret yüklenmiş. Kesecik kapalıyken içi asitlidir; zarla kaynaşıp dışarıya açıldığı an işaret yanar.

Arın üç kabı sırayla mikroskoba koyuyor. Birincisine hiçbir şey eklenmiyor; hücrenin kenarında dakikalarca tek tük kıvılcımlar yanıp sönüyor. İkincisine hücre yüzeyindeki bir reseptöre bağlanan uyarıcı bir madde katılıyor: birkaç saniye içinde kenar onlarca noktada birden tutuşuyor. Üçüncüye uyarıcı yerine kalsiyumu zardan geçiren bir iyonofor ekleniyor; kenar yine tutuşuyor. Kıvılcımların hepsi aynı davranmıyor: bir kısmı halka gibi genişleyip soluyor, bir kısmı olduğu yerde bir an yanıp sönüyor.

"Uyarıcıya gerek yokmuş," diyor Arın. "Kalsiyum yetiyor." Selvi Hanım başını sallıyor ama ekliyor: "Birinci kaptaki kıvılcımlar kimseyi beklemedi. Yayılanlar zara karıştı; yerinde sönenler ya kapıyı aralayıp geri çekildi ya da biz öyle sanıyoruz."

Bu derste ne olacak

Keseciğin dışarı açıldığı iki yolu ayıracak, kaynaşmayı yapan protein demetini ve onu tetikleyen kalsiyum algılayıcısını izleyeceğiz. Füzyon gözeneğinin iki sonunu tartıştıktan sonra hücre yüzeyine eklenen ve geri alınan zarı hesapla dengeleyeceğiz.

Mekanizma

İki salgı yolu

Endositoz dersinde zar bir yükü sarıp içeri kopardı. Tersi de her hücrede olur.

Wikipedia'nın ekzositoz maddesi bu kaynaşmanın üç sonucunu birlikte sayar: plazma zarının yüzeyi keseciğin yüzeyi kadar büyür, içerik dışarı çıkar ve kesecik zarındaki proteinler yüzeyin proteini olur. Hücre dışı matriks proteinleri ve sinir uçlarındaki nörotransmiterler OpenStax'in Biology kitabında bu yolla salınan maddeler arasında sayılır.

Ekzositozun iki türü ayrılır. Wikipedia yapısal (constitutive) ekzositozun bütün hücrelerde durmadan işlediğini, yeni yapılmış zar proteinlerini ve hücre dışı matriksin bileşenlerini yüzeye taşıdığını yazar. Hücre görsel haritasında izlediğimiz kırmızı ok, ER'den Golgi'ye, Golgi'nin öbür yüzünden bir keseciğe, oradan da zara uzanıyordu; yapısal yol o okun kesintisiz akan hâlidir. Arın'ın birinci kabındaki dağınık kıvılcımlar bu yola benzer.

Hücre tipleri ve özelleşmeyi işlediğimiz derste pankreasın asiner hücresinde sindirim enzimlerinin zimojen granüllerinde depolandığını ve granüllerin hücrenin tepesinde toplandığını görmüştük. Wikipedia'nın asiner hücre maddesi bu enzimlerin bir hormon ya da bir nörotransmiter hücreyi uyardığında salındığını yazar. Messenger, Falkowski ve Groblewski'nin 2014 derlemesi granül salgısını kalsiyum ve öteki hücre içi habercilerin denetlediğini, aynı hücrede kayda değer bir yapısal salgının da sürdüğünü ekler. NobelPrize.org'un 2013 bildirisi de insülini keseciklerle dışarı verilen moleküllere örnek gösterir.

Dört sarmallı fermuar

İki zar kendiliğinden kaynaşmaz. Wikipedia'nın SNARE maddesine göre zarları birbirine yaklaştırmak için aralarındaki elektriksel itmeyi yenecek bir enerji gerekir; bu işi bir protein ailesi görür.

Südhof ile Rothman'ın 2009 Science derlemesine göre ad, hücresiz bir sistemde saflaştırılan NSF ve SNAP proteinlerine bağlanan zar proteinlerinden, "SNAP reseptörü"nden gelir. Aynı derleme ile Wikipedia'nın SNARE maddesi sinir ucundaki üçlüyü aynı biçimde verir: keseciğin zarında sinaptobrevin (VAMP olarak da bilinir), plazma zarında sintaksin-1 ve SNAP-25. Wikipedia demetin dört sarmalından birini sinaptobrevinin, birini sintaksinin, ikisini SNAP-25'in verdiğini yazar; Jahn ile Fasshauer'in 2012 Nature derlemesi de her sarmalın ayrı bir SNARE bölgesinden geldiği dört paralel sarmalı anlatır.

Jahn ile Fasshauer'e göre demet zarlardan uzak uçta başlar ve zar çapalarına doğru ilerleyerek kapanır; bu fermuar hareketi (zippering) zarları sıkıca birbirine çeker. NobelPrize.org'un 2013 bildirisi de kesecikteki ve hedef zardaki proteinlerin "bir fermuarın iki yakası gibi" birleştiğini yazar. Kaynaşmadan sonra tek zarda kalan demet, Wikipedia ile Südhof–Rothman derlemesine göre, ATP harcayan NSF ile yardımcısı α-SNAP tarafından çözülür ve SNARE'ler yeni bir tur için serbest kalır. ATP fermuar kapanırken değil, demet açılırken harcanır.

Südhof ile Rothman ve Wikipedia'nın SNARE maddesi, sinir ucundaki bu proteinlerin botulinum ve tetanoz toksinleri tarafından kesildiğini ve bu seçici proteazların keseciğin kaynaşmasını durdurduğunu, SNARE'lerin füzyondaki merkezî yerinin kanıtlarından biri olarak yazar.

Wikipedia ile NobelPrize.org, 2013 fizyoloji ya da tıp Nobel'inin James Rothman, Randy Schekman ve Thomas Südhof'a hücre içi kesecik trafiğini düzenleyen makineyi buldukları için verildiğini yazar. Bildiriye göre Schekman mayada trafiğin genlerini, Rothman kaynaştıran kompleksi, Südhof kaynaşmayı zamanlayan kalsiyuma duyarlı düzeneği buldu.

Kalsiyum tetiği

Zar onarımını işlediğimiz derste bir reseptörün IP₃ üzerinden ER'deki depoyu boşaltıp sitozol kalsiyumunu kısa süreliğine on ile yüz kat yükseltebildiğini görmüştük. Arın'ın ikinci kabındaki uyarıcı bu yolu işletir, üçüncü kaptaki iyonofor reseptörü atlar. İki kabın aynı sonucu vermesi tetiğin kalsiyum olduğunu gösterir.

Kalsiyumu okuyan protein sinaptotagmindir. Jahn ile Fasshauer ve Wikipedia onu keseciğe tek bir zar geçen bölgeyle bağlı, sitozole C2A ve C2B adlı iki kalsiyum bağlayan bölge uzatan bir protein olarak tarif eder. İki kaynağa göre yarı kapanmış SNARE demetini tutan kompleksin adlı kıskacı, büyük olasılıkla kalsiyum bağlayan sinaptotagmin kaldırır. Kesecik kalsiyumdan önce yarı kapanmış bir fermuarla zara yapışık bekler.

Kanalları işlediğimiz derste gerilim kapılı kanalı, zar gerilimi değişince açılan kapılı kanal olarak tanımlamıştık. Akson ucuna gelen elektrik değişimi gerilim kapılı kalsiyum kanallarını açar; NobelPrize.org'a göre içeri akan kalsiyum bekleyen kesecikleri hemen kaynaştırır, Südhof'un 2013 derlemesi de kanalların kenetlenmiş keseciklerin yakınında durduğunu yazar. Sinapsın yapısı ve alıcı hücre L04 Sinir Sistemi'nde işlenecek.

Gözeneğin iki sonu

Jahn ile Fasshauer zarların önce kum saati biçiminde bir sapla birleştiği modeli anlatır; Wikipedia bu aşamalar için birden çok modelin tartışıldığını yazar. Gözenek açıldıktan sonra iki yol vardır. Wu ile arkadaşlarının 2014 derlemesine göre tam birleşmede (full-collapse fusion) gözenek genişler ve kesecik düzleşerek zara karışır. Öp ve kaç (kiss-and-run) denen yolda ise gözenek açılıp kapanır; Alabi ile Tsien'in 2013 özeti keseciğin biçimini koruduğunu, hızla geri alınıp yeniden kullanılabildiğini yazar. Arın'ın halka gibi yayılan kıvılcımları ilkine, yerinde sönenleri ikincisine benzer.

Yüzeyin muhasebesi

Endositoz dersinde 100 nanometrelik bir keseciğin 0,0314 µm² zar götürdüğünü, 20 mikrometre çaplı kurgu hücrenin yüzeyinin 1.257 µm² olduğunu bulmuştuk. Tam birleşen kesecik aynı alanı ekler: 0,0314 ÷ 1.257 ≈ 0,000025, yani yüzeyin yüz binde 2,5'i. Yüzeyi yüzde bir büyütmek için 12,57 ÷ 0,0314 ≈ 400 kesecik gerekir.

Kurgu hücrenin yüzeyini saatte bir kez içeri almak için dakikada 670 kesecik koparması gerektiğini hesaplamıştık. Yüzey sabit kalacaksa ekzositoz da aynı boyda dakikada 670 kesecik eklemelidir. Fark küçük olsa da birikir: ekzositoz dakikada 680 olsaydı saatte 10 × 60 = 600 kesecik fazladan eklenir, 600 × 0,0314 ≈ 18,8 µm² eder; bu da yüzeyin saatte yaklaşık yüzde 1,5'idir. Wu ekibi ekzositozun ardından endositozun geldiğini ve kesecik zarının bu eşleşmeyle geri alındığını anlatır; Wikipedia da kaynaşan sinaptik keseciklerin endositozla toplandığını yazar.

Salgı granülleri çok daha iri olabilir. Bir mikrometre çaplı kurgu bir granülün yüzeyi 4 × π × 0,5² ≈ 3,14 µm², yani yüz tane 100 nanometrelik kesecik eder. Uyarılan kurgu hücre dakikada beş granül boşaltırsa 15,7 µm² ekler ve yalnız bunu geri almak için dakikada 500 küçük kesecik koparması gerekir.

Sinir ucundaki kesecikler çok daha küçüktür. Wikipedia çaplarını 40 nanometre civarında verir; Milo ile Phillips'in verdiği yaklaşık 10⁻⁵ µm³'lük hacim de aynı mertebededir. Dört nanometrelik zar düşülünce iç yarıçap 16 nanometre, iç hacim 4 ÷ 3 × π × 16³ ≈ 17.200 nm³, yani 1,72 × 10⁻²⁰ litre eder. Derişim kurgu olarak litrede 0,15 mol alınırsa 1,72 × 10⁻²⁰ × 0,15 × 6,02 × 10²³ ≈ 1.550 molekül bulunur. Milo ile Phillips kesecik başına 10³ ile 10⁴ molekül, Wikipedia asetilkolin için ilk tahminin 1.000–2.000 molekül olduğunu yazar; hesap mertebeyi tutturur.

Modelin sınırı

• Yüzey hesabı her keseciğin tam birleştiğini varsayar. Öp ve kaçla boşalan kesecik kalıcı zar eklemez ve bu yolun payı tartışmalıdır.
• Hücreyi pürüzsüz bir küre saydık, iki akışı tek boy kesecikle hesapladık; granülün boyu ve sayısı kurgudur.
• Molekül hesabında derişim kurgudur ve kesecikler arasında aynı kalmaz; iç yarıçap dört nanometrelik zar varsayımıyla bulundu.
• Fermuarın zarları nasıl kaynaştırdığı açık değildir. Jahn ile Fasshauer yarı kapanmış demetin enerji depolayan gergin bir yapı mı, gevşek bir yapı mı olduğunun tartışıldığını yazar.
• Yapısal yolun makinesi daha az çalışılmıştır; sinir ucundan öğrenilen ayrıntılar her salgı hücresine olduğu gibi taşınamaz.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Kesecik kaynaşmasının kalsiyuma bağlı olması, bir kişinin hormon salgısı ya da sinir iletimi hakkında hiçbir şey söylemez. Salgıyı "artırdığı", sinir hücrelerinin verici maddesini "çoğalttığı" ileri sürülen hiçbir besin, takviye ya da ürün bu şemaya dayanamaz.

Halkalar ve noktalar

Öğleye doğru rüzgâr yeniden çıkıyor. Arın defterine iki çizim yapıyor: zarın içine düzleşmiş bir kesecik, yanına "tam birleşme, +0,0314 µm²"; zara bir boğazla bağlı bir kesecik, yanına "öp ve kaç, +0". Altına çarşambadaki okun ters yönlü eşini çizip ikisini "670 = 670" diye bağlıyor.

"Hücre her dakika içini dışına çeviriyor," diyor Arın, "ama boyu değişmiyor." Selvi Hanım iki okun ortasına bir soru işareti çiziyor. "Değişmiyor, çünkü içeri alınan kesecik bir gün yine dışarı açılacak. Hangisinin nereye gideceğini kim söylüyor, ona pazartesi bakarız."

Kendini sına

1. Kurgu hücre 10 mikrometre çapında olsaydı, 100 nanometrelik tek bir keseciğin tam birleşmesi yüzeyin kaçta kaçını eklerdi?
2. Ekzositoz dakikada 700, endositoz 670 kesecikte kalsaydı, 100 nanometrelik keseciklerle kurgu hücrenin yüzeyi bir saatte yüzde kaç büyürdü?
3. Dış çapı 50 nanometre olan bir kesecikte zar dört nanometre ise, aynı kurgu derişimle kabaca kaç molekül taşınırdı?
4. Birinci kaptaki dağınık kıvılcımlar neden uyarıcı ya da iyonofor olmadan da görüldü? Hangi ekzositoz türüne benziyorlar?
5. Bir hücrede keseciklerin çoğu öp ve kaçla boşalsaydı, yüzeyin sabit kalması için endositozdan beklenen iş nasıl değişirdi?

Bir sonraki derse köprü

Veziküler Trafik dersi keseciğin nereden çıktığını ve adresini nereden bildiğini soracak: Golgi'nin trans yüzündeki trans-Golgi ağı yükleri nasıl ayırır, ER ile Golgi arasında gidip gelen COPII ve COPI kaplı kesecikler neyle ayrışır, Rab GTPazlar bir keseciğin hangi zara yanaşacağını SNARE eşleşmesinden önce nasıl işaretler?