Endositoz

Soğukta ışıyan kenarlar

Çarşamba sabahı ayaz yok; ince bir çisenti bodrum penceresini buğuluyor, dışarıda yalnız ıslak kaldırım taşları seçiliyor. Selvi Hanım buzdolabından "kültür hücresi + floresanlı transferrin" şişesini alıyor. Tezgâhta, tabanında hücre üreyen dört cam kap buz kovasında bekliyor.

Arın dört kaba da floresanlı transferrin ekliyor; yarım saat buzda bekleyen kaplar yıkanıyor. Birincisi buzda kalıyor; ikincisi beş dakika, üçüncüsü yirmi dakika 37 dereceye alınıyor. Dördüncüsü de ısıtılıyor, ama ortamına dinamini durduran bir madde katılmış. Mikroskopta birinci kaptaki hücrelerin kenarı ince, parlak bir çizgi hâlinde ışıyor. İkincide çizgi sönmüş, zarın hemen altında yüzlerce parlak nokta var. Üçüncüde noktalar çekirdeğin yanında bir kümede toplanmış. Dördüncüde kenar çizgisi kalınlaşıp boncuk boncuk olmuş, ama içeri tek nokta girmemiş.

"Transferrin zardan geçmedi," diyor Arın. "Zar onu içine aldı." Selvi Hanım dördüncü kabı gösteriyor. "Zar katlanmış, cebi kurmuş. Cebi koparan olmayınca yük kapıda kalıyor."

Bu derste ne olacak

Dört cebi, zarın yük alırken kurduğu biçimleri karşılaştıracak, klatrin kaplı çukuru reseptörden adaptöre, dinaminden kılıfın sökülmesine dek izleyeceğiz. Bir keseciğin kaç lipit taşıdığını, bir hücrenin yüzeyini ne kadar sürede içeri aldığını hesaplayacağız. Sonra LDL'yi ve transferrini asitlenen endozomda reseptörlerinden ayrılırken göreceğiz.

Mekanizma

Kapı yoksa zar katlanır

Su, iyon ve şeker şimdiye dek ya lipit tabakasının arasından ya da bir proteinin içinden yol buldu. Transferrin gibi iri bir protein, hele bir bakteri, ne çift tabakada çözünür ne bir gözeneğe sığar; zar ona başka bir çözüm sunar.

OpenStax'in Biology kitabı da Wikipedia'nın endositoz maddesi de temel ayrımı aynı yerden yapar: hücre ya parçacık yer ya da sıvı içer. Fagositozda (phagocytosis) hücre yarım mikrometreden büyük bir parçacığı, bir bakteriyi ya da ölmüş bir hücreyi sarar. Swanson'un 2008 derlemesi bu fincanın aktin iskeletinin itmesiyle, reseptörlerin parçacık yüzeyini fermuar gibi izlemesiyle kurulduğunu yazar. Zar Asimetrisi dersinde makrofajların ölen hücreyi dış yaprağa çıkmış fosfatidilserinden, o "beni ye" işaretinden tanıdığını görmüştük; tanımadan sonraki yutma adımı buydu.

Makropinositozda (macropinocytosis) zarın kıvrımları kapanarak bir yudum dış sıvıyı çevreler. Swanson bu keseleri 0,2–5, Wikipedia 0,5–5 mikrometre verir; iki durumda da yük seçilmez. Kaveolalar ise zardaki küçük şişe biçimli çukurlardır. Parton ile arkadaşlarının 2020 derlemesi onları 60–80 nanometre, Wikipedia 50–100 nanometre olarak verir; ikisi de kaveolin ve kavin proteinlerini, kolesterol ile sfingolipitçe zengin zarı anar. Wikipedia onları özel bir lipit salı türü sayar; Lipit Salları dersindeki bölgelerin mikroskopta görünen bir akrabasıdır. Parton'a göre kaveolalar zar gerilince düzleşip zara yedek yüzey verir.

Çukurun kafesi

Dördüncü yol, fagositozun iri parçacıklarda yaptığı seçimi tek tek moleküller için yapar.

Reseptörü, zar yırtıklarının kapanışını ve ikincil habercileri gördüğümüz derste bir sinyali karşılayan protein olarak tanımıştık; burada aynı tür protein bir taşımayı başlatır. Taşımanın iskeleti klatrindir. Wikipedia'nın klatrin maddesi ile Mettlen ve arkadaşlarının 2018 derlemesi yapı taşını aynı biçimde tarif eder: üç ağır ve üç hafif zincirden kurulu, üç bacaklı bir yıldız, triskelion (triskelion). Triskelionlar birbirine kenetlenip beşgen ve altıgenlerden bir ağ örer. Wikipedia ile Johnson'ın 2024 Journal of Cell Science derlemesi, kapalı bir kafesin ancak tam on iki beşgenle kurulabileceğini yazar; futbol topunun dikişleri gibi.

Klatrin zara da yüke de doğrudan tutunamaz. Aradaki bağı adaptörler kurar. Mettlen ekibi başlıca adaptörü, AP2'yi, dört alt birimli bir kompleks olarak anlatır: çekirdeği zardaki fosfoinozitid lipidine tutunur, β2 alt birimi klatrini, μ2 alt birimi reseptörlerin sitozol kuyruğundaki kısa işaret dizilerini bağlar. Wikipedia'nın AP2 maddesi de klatrin bağlama yerini β, yük bağlama yerini μ alt biriminde gösterir. Zar Proteinleri dersinde zarı bir kez geçen proteinleri tek bir transmembran sarmalla tanımıştık; böyle bir reseptörün sitozole sarkan kuyruğu yükün seçildiği yerdir. Transferrin reseptöründe bu işaret tirozinli bir dizidir, LDL reseptörü ailesinde NPxY adlı dört harflik bir dizi.

Kopma ve kılıfın sökülmesi

Çukur derinleşip bir balon gibi yalnız ince bir boyunla zara bağlı kaldığında dinamin devreye girer. Wikipedia'nın dinamin maddesi bu GTPazın boyna sarmal bir halka gibi sarıldığını, GTP'yi yıkarken halkayı sıkıp zarı kopardığını yazar; Mettlen ekibi de dinamini derin çukurun boynunda zarı koparan enzim olarak anlatır. Arın'ın dördüncü kabındaki boncuklar buydu: çukur kurulmuş, boyun kesilmemişti.

Kopan keseciğin kafesi hızla sökülür. Paraan ile arkadaşlarının 2020 çalışması, ATP harcayan Hsc70 şaperonunun klatrinde tutunduğu kısa diziyi yapıda gösterir ve sökülmeyi ona bağlar; Mettlen'in tablosu da Hsc70'i söküm adımında sayar. Çıplak kesecik eşleriyle birleşip erken endozomla kaynaşır. Johnson'a göre bütün döngü memeli hücrelerinde 60–120 saniye sürer ve hücre tipine göre 60 ile 120 nanometre çaplı kesecikler verir; Wikipedia yaklaşık 100 nanometre ve bir dakika yazar.

Bu çapla bir kesecik ne kadar zar götürür? 100 nanometre çaplı bir kürenin yüzeyi 4 × π × 50² ≈ 31.400 nm²'dir. Fosfolipit Çift Tabaka dersindeki 0,65 nm² ile tek yaprakta 31.400 ÷ 0,65 ≈ 48.300 lipit düşer, iki yaprakta 97.000 dolayında; iç yaprak biraz küçük olduğundan gerçek sayı biraz daha azdır. Bu sayıyı Lipit Salları dersinde 200 nanometrelik düz bir sal için de bulmuştuk: π × 100² ile 4 × π × 50² aynı alanı verir. Aralığın iki ucunda aynı hesap 60 nanometre için yaklaşık 35.000, 120 nanometre için 139.000 verir.

Yüzeyi 1.257 µm² olan, 20 mikrometre çaplı kurgu bir küre hücre alalım. Bir kesecik 0,0314 µm² götürdüğüne göre yüzeyin tamamı 1.257 ÷ 0,0314 ≈ 40.000 kesecik eder. Hücre bunu bir saatte içeri alacaksa dakikada 40.000 ÷ 60 ≈ 670 kesecik koparmalıdır. Wikipedia kültür hücrelerinde dakikada birkaç yüzden bine kadar kesecik oluştuğunu yazar. Huotari ile Helenius'un 2011 derlemesi de memeli hücrelerinin saatte yüzeylerinin yarısı ile neredeyse iki katı kadar zarı içeri alıp geri verdiğini aktarır. Bu kesecikler hacimce ise küçüktür: 40.000 kesecik yalnız 21 µm³ sıvı taşır, kurgu hücrenin hacminin binde beşi kadar. Küçük bir kesecik sıvıdan çok zar taşır; çapı on kat büyük bir makropinozom yüz kat zar, bin kat sıvı yutar.

LDL: seçilen yük, dönen reseptör

Kavram, kolesterol taşıyan LDL parçacığıyla doğdu. NobelPrize.org ve Wikipedia'nın LDL reseptörü maddesi, Michael Brown ile Joseph Goldstein'ın 1985 yılının fizyoloji ve tıp Nobel'ini kolesterol metabolizmasının düzenlenmesine ilişkin buluşları için paylaştığını yazar. Başlangıç noktaları ailesel hiperkolesterolemi denen kalıtsal bir hastalıktı; biz reseptörü yalnız hücre biyolojisi içinde izleyeceğiz.

Goldstein ile Brown'ın 2009 derlemesi, Richard Anderson ile elektron mikroskobunda LDL'ye bağlı reseptörlerin kaplı çukurlarda kümelendiğini gördüklerini anlatır. Belirleyici gözlem, LDL'yi bağlayan ama içeri alamayan mutant fibroblastlardan geldi: reseptörleri çukurların dışında kalıyordu. Kusur sitozol kuyruğunda tek bir amino asit değişikliğiydi ve NPVY dizisine düşüyordu. Nobel basın bildirisi ve Wikipedia'nın maddesi de kusuru reseptörün içerideki kuyruğuna yerleştirir.

Nobel konuşmasına göre endozomun pH'ı ATP ile çalışan proton pompaları sayesinde 6,5'in altına düşer, LDL reseptörden kopar; reseptör endozomun bir parçasıyla yüzeye döner, LDL ise lizozoma gider. Aynı konuşma ve 2009 derlemesi reseptörün her on dakikada bir tur attığını ve yirmi saatlik ömründe birkaç yüz tur tamamladığını yazar. Kaba bölme 20 × 60 ÷ 10 = 120 verir; iki sayı ancak mertebede buluşur. Konuşma, reseptörün dolu da olsa boş da olsa bu turu sürdürdüğünü ekler.

Transferrin: demir asitte bırakılır

Dautry-Varsat, Ciechanover ve Lodish 1983'te iki demirli transferrinin reseptörle içeri alındığını, pH 5,5 ya da altına inen kesecikte demirin bırakıldığını ve demirsiz transferrinin, apotransferrinin, reseptöre bağlı kaldığını bildirdi. Kompleks yüzeye döner, dışarının nötr pH'ında apotransferrin reseptörden ayrılır. Wikipedia'nın transferrin maddesi de demirin 5,5 dolayındaki asitte bırakıldığını ve reseptörün yeni bir tur için yüzeye döndüğünü yazar.

Hücresel Bölmelendirme dersinde sitozolün pH'ını 7,2 almış, lizozomun yüzlerce kat daha asitli olduğunu bulmuştuk. Demirin bırakıldığı 5,5'te fark 1,7 birimdir ve 10^1,7 ≈ 50 eder: endozomda hidronyum sitozoldekinin elli katı kadardır. Pompa ailelerini karşılaştırırken andığımız V tipi pompalar bu farkı kurar.

Endozom olgunlaşır

Wikipedia'nın endositoz maddesi erken endozomu hafif asitli, ince borucuklu bir ayrım bölmesi olarak anlatır; reseptörlerin çoğu bu borucuklardan yüzeye döner. Huotari ile Helenius erken endozomun pH'ını 6,8 ile 5,9, geç endozomunkini 6,0 ile 4,9 arasında verir. Endozom çekirdeğe doğru ilerledikçe asitlenir, içine küçük kesecikler dolar ve sonunda lizozomla kaynaşır; Wikipedia'nın endozom maddesine göre geç endozom bu kaynaşmada tükenir, adım geri dönmez. Arın'ın üçüncü kabındaki küme ise dönüş yolundaydı: aynı madde yüzeye dönen yükün çoğunun geri dönüşüm endozomlarından geçtiğini, Huotari ile Helenius da bu endozomların çekirdek çevresinde toplandığını yazar. Endozomun kimliğinin hangi proteinlerle değiştiğini ve keseciklerin doğru adrese nasıl gittiğini Veziküler Trafik dersi açacak.

Modelin sınırı

• Kesecik hesabı kafesin çapını zarın çapı sayar. Paraan ekibi beyinden saflaştırılmış kafeslerin içindeki zar keseciklerini 22–55 nanometre ölçmüştür; lipit sayısı bir üst sınırdır.
• Kurgu hücre pürüzsüz bir küredir; gerçek yüzey kıvrımlıdır ve zar başka yollarla da içeri alınır. Dakikada 670 bir mertebe karşılaştırmasıdır.
• Dört yolun sınırları keskin değildir; Wikipedia yolların artık klatrine ve dinamine bağımlılığa göre sınıflandığını yazar. Kaveolaların ne kadar yük taşıdığı tartışmalıdır.
• On dakikalık tur ve yirmi saatlik ömür kültür hücrelerindeki ölçümlerden gelir; hücre tipine ve koşula göre değişmesi beklenir.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. LDL döngüsü bir kişinin kolesterol değerini, transferrin döngüsü de demir durumunu açıklamaz. Endositozu "hızlandırdığı" ya da besinleri hücreye "taşıdığı" söylenen bir ürün bu şemaya yaslanamaz. Bazı virüsler de bu cepleri kullanarak içeri girer; bu, yolun seçiciliğinin taklit edilebildiğini gösterir.

Çekirdeğin yanındaki küme

Öğleye doğru çisenti diniyor; Arın defterine üç şekil çiziyor: düz bir zar, boyunlu bir balon, bir kesecik. Balonun boynuna "dinamin", kesecik ile yüzey arasına iki yönlü bir ok, okun altına "10 dk" yazıyor. "Reseptör kapıyı açmıyor," diyor. "Cebi kendi yüküyle dolduruyor, sonra boş dönüp yenisini bekliyor."

Selvi Hanım okun ucuna "pH 5,5" ekliyor. Kaplar kuluçka dolabına dönerken buzdolabının rafında yeni bir şişe duruyor: "salgı keseli kültür hücresi + kalsiyumlu tampon". Notu kısa: "Cuma. Bu kez kesecik dışarı açılacak."

Kendini sına

1. Kesecik çapı 80 nanometre olsaydı yüzeyi ve iki yapraktaki lipit sayısı kabaca ne olurdu? 0,65 nm² ile hesapla.
2. Kurgu hücrenin çapı 10 mikrometre olsaydı, yüzeyini bir saatte içeri almak için dakikada kaç tane 100 nanometrelik kesecik gerekirdi?
3. Çapı 0,5 mikrometre olan bir makropinozom, 100 nanometrelik bir keseciğe göre kaç kat hacim, kaç kat zar taşır?
4. Endozomun pH'ı 6,5'te kalsaydı LDL reseptörünün ve transferrinin döngüsünde ne aksardı?
5. Dördüncü kaptaki hücrelerde transferrin neden kenarda boncuk boncuk birikti de içeri girmedi?

Bir sonraki derse köprü

Ekzositoz dersi aynı yolu ters yönde soracak: içerideki bir kesecik plazma zarıyla nasıl kaynaşır, SNARE proteinleri iki zarı ne kadar yaklaştırır ve füzyon gözeneği açılırken içerik dışarı nasıl verilir? Zar onarımını anlattığımız derste yırtığı kapatan, kalsiyumla tetiklenen ekzositozu görmüştük; düzenlenmiş salgıda kalsiyum aynı tetiği mi çeker?