Taşıyıcı Aracılı Taşınım

Kapağındaki notun pazartesisi

Pazartesi sabahı ayaz geri dönmüş; bodrum penceresinin önündeki çimen yine beyaz. Selvi Hanım buzdolabından "İ + GLUT1" şişesini alıp kapağındaki notu tezgâhın kenarına yapıştırıyor. Bu keselerin lipitleri perşembe günkü "İ" harmanıyla aynı; farkı, zarlarına alyuvardan saflaştırılmış glukoz taşıyıcısı katılmış olması.

Cihazın yanında altı tüp var: dış çözeltide 1, 2, 4, 8, 16 ve 32 milimol/L işaretli glukoz. Arın her karıştırmanın ilk saniyelerindeki giriş hızını milimetrik kâğıda işliyor. Yalnız lipitten oluşan "İ" keselerinin noktaları yatay eksene yapışık kalıyor. GLUT1'li keselerin noktaları önce hızla tırmanıyor, 8'den sonra yatıyor; 32'deki nokta 16'dakinin ancak biraz üstünde.

Selvi Hanım buz banyosundan içi önceden işaretsiz glukozla doldurulmuş keseleri çıkarıyor. Dışarıdaki işaretli glukoz bunlara boş olanlardan belirgin biçimde hızlı giriyor. "İçerisi doluyken daha mı hızlı giriyor?" diyor Arın. "Kapı kalabalıkta açılmaz, kapanır sanırdım."

Bu derste ne olacak

Taşıyıcının dört adımlı döngüsünü ve kristallerde yakalanan biçimlerini kuracağız. Sonra eğrinin bükülmesini, bir döngünün kanaldaki bir iyon geçişinden on binlerce kat uzun sürmesini ve dolu keselerin hızını hesaplayacağız.

Mekanizma

Hiçbir an iki yüze açık olmayan cep

Kolaylaştırılmış Difüzyon dersinde (L02-P07-M01-D05) tek yönlü taşıyıcıyı, cebi önce bir yüze sonra öbürüne dönen bir protein olarak tanımlamış, D-glukozu ayna eşinden ayırdığını görmüştük. Bu derste o tanımın içindeki hareketi açacağız.

Drew ile arkadaşlarının 2021 derlemesi, bağlanma yeri iki yüze sırayla açılan bir protein fikrini Jardetzky'nin 1966'da Nature'da yayımladığı iki sayfalık nota dayandırır; Carruthers ekibi de basit taşıyıcı modelinin kaynakları arasında aynı notu sayar. Notun başlığı "zar pompaları için basit bir allosterik model"di.

Döngü dört adımda okunur. Dışa açık cebe bir glukoz oturur. Protein biçim değiştirir; bir ara aşamada cep iki yandan da kapanır ve şeker içeride tutulur. Cep içe açılır ve glukoz sitozole bırakılır. Sonra boş protein yeniden dışa açık biçime döner. Hızın asıl dördüncü adımda saklandığını birazdan göreceğiz.

Drew ile arkadaşları bu ara biçimi enzim tepkimesindeki geçiş hâlinin karşılığı sayar. Hücrenin kurduğu farklar da onun sayesinde korunur: cep hiçbir an iki yana birden açılmadığı için zar boyunca sızıntı yolu oluşmaz.

Kristalde yakalanan iki yüz

Glukoz taşıyıcısı için model onlarca yıl yapısız kaldı; Deng ile arkadaşları 2014'te Nature'da insan GLUT1'inin 3,2 ångström çözünürlüklü kristal yapısını yayımladı: protein büyük kolaylaştırıcı üst ailesinin (major facilitator superfamily, MFS) tipik katlanmasını taşıyordu ve içe açık biçimde yakalanmıştı. Aynı ekip ertesi yıl akrabası GLUT3'ü D-glukozla birlikte, bu kez dışa bakan ve cebi kapanmış biçimde çözdü. Drew ile arkadaşlarının derlemesi iki yapıyı aynı döngünün durakları sayar.

On iki zar geçen sarmal altışarlı iki yarı kurar ve cep bu iki yarının arasında kalır. Deng ekibinin 2015 karşılaştırmasına göre glukozu başlıca C-uç yarısındaki polar yan zincirler tutar; N-uç yarısı ona göre katı bir blok gibi döner. Wikipedia'nın MFS maddesi bu hareketi klasik adıyla "tahterevalli anahtarı" (rocker-switch) diye anar: bir yüz açılırken karşı yüz mühürlenir. Drew ile arkadaşları dönüşümlü erişimin bir başka çeşidi olarak "sallanan demet"i (rocking-bundle) sayar; Forrest ile Rudnick bu düzeni 2009'da bakteriyel LeuT taşıyıcısı için tarif etmişti.

Eğrinin büküldüğü yer

Bükülme bu döngüden gelir: kesede sayılı taşıyıcı vardır ve her biri bir anda en çok bir glukoz taşır. Michaelis–Menten bağıntısını, Vmax'ı ve Km'yi Enzimlerin Katalitik Rolü dersinde (L02-P06-M05-D08) tanımlamış, Kolaylaştırılmış Difüzyon dersinde GLUT1'e uygulamıştık. Yeni olan tavanın fiziksel anlamıdır: glukoz ne kadar artarsa artsın, her taşıyıcı döngüsünü kendi hızıyla tamamlar.

Açılıştaki kurgu keselerde Vmax 60 birim, Km 2 milimol/L olsun. 1 milimol/L'de hız 60 × 1 ÷ 3 = 20, 2'de tam 30'dur. Km'nin iki katında, 4 milimol/L'de, 60 × 4 ÷ 6 = 40 birim çıkar; derişim ne olursa olsun [S] = 2Km yazılınca kesir 2Km ÷ 3Km = 2/3'e iner. 16'dan 32'ye çıkınca hız 53,3'ten 56,5'e, yalnız 1,06 katına yükselir.

Arın'ın biriminde 60, kese başına saniyede 12.000 glukoz olsun. Enzim dersinde devir sayısını Vmax'ın enzim miktarına bölümü diye tanımlamıştık; Carruthers ile arkadaşlarının GLUT1 için verdiği saniyede yaklaşık 1.200 devirle 12.000 ÷ 1.200 = 10, yani kese başına ortalama on çalışan taşıyıcı. Tavanı taşıyıcı sayısı ile döngü hızı birlikte belirler.

Cebe oturup taşınmayan bir molekül de eğriyi büker. Carruthers ekibine göre maltoz dıştaki giriş yerine bağlanır ama taşınmak için fazla büyüktür; Deng ekibi GLUT3'ü maltozla dışa açık biçimde yakalamıştı. Bu, enzim dersindeki kompetitif inhibisyonun taşıyıcıdaki karşılığıdır. Kurgu keselere ayrışma sabitine eşit derişimde maltoz eklenirse görünür Km 2 × (1 + 1) = 4 olur: 4 milimol/L'de hız 60 × 4 ÷ 8 = 30'a düşer, 32'de ise 60 × 32 ÷ 36 ≈ 53,3'te kalır. Glukoz yeterince artınca tavan geri gelir.

Döngünün en yavaş adımı

Kaynaklar devir hızında tek sayıda buluşmaz. Wikipedia'nın zar taşıma proteini maddesi taşıyıcı için saniyede 100 ile 1.000 molekül, açık kanal için milyonlarca iyon yazar; Milo ile Phillips şeker taşıyıcılarına 30 ile 300 arasını verir, Drew ile arkadaşları GLUT'larda 6.500'e varan değerler aktarır. Aralık yüzlerden birkaç bine uzanır ve GLUT1'in 1.200'ü içindedir.

Bir döngü 1 ÷ 1.200 ≈ 0,83 milisaniye sürer. Kanal Aracılı Taşınım dersinde bir potasyum iyonunun filtreyi on nanosaniye dolayında aştığını bulmuş, kurgu kanalımızdan saniyede 9,4 × 10⁶ iyon geçirmiştik. Taşıyıcı tek döngüsünü tamamlarken aynı kanaldan 9,4 × 10⁶ × 0,00083 ≈ 7.800 iyon geçer. Kanalda iyon hazır bir yolda ilerler, taşıyıcıda ise proteinin yarısı öbür yarısına göre dönmek zorundadır.

Lowe ile Walmsley 1986'da alyuvarda glukoz girişini 0 ile 53 °C arasında ölçüp taşıyıcının dört hız sabitini çıkardı. 0 °C'de glukozla yüklü taşıyıcı saniyede 90,3 kez dışa dönerken boş taşıyıcı yalnız 0,726 kez dönüyordu: 90,3 ÷ 0,726 ≈ 124 kat. İçe doğru oran 1.113 ÷ 12,1 ≈ 92'dir. Drew ile arkadaşları da GLUT1'de boş taşıyıcının içten dışa dönüşünün döngünün en yavaş adımı olduğunu, bağlanmış şekerle geçişin kabaca yüz kat hızlı yürüdüğünü yazar.

Boş keseye glukoz giren her taşıyıcı içeride yükünü bırakır ve dışarıya boş döner; döngüyü yavaş adım belirler. İçi glukozla dolu kesede taşıyıcı içe açıldığında çoğu kez yeni bir şeker bulur ve dışarıya yüklü döner. Lowe ile Walmsley'nin 0 °C sabitleriyle net giriş döngüsü 1 ÷ (1 ÷ 1.113 + 1 ÷ 0,726) ≈ 0,73, iki yönde de yüklü giden döngü 1 ÷ (1 ÷ 1.113 + 1 ÷ 90,3) ≈ 83,5 devir/saniye eder; oran yaklaşık 115'tir. Kalabalık kapıyı kapatmaz; dönüş yolunu yükler.

Carruthers ile arkadaşlarına göre etki soğukta belirgindir ve sıcaklık yükseldikçe değiş-tokuş ile net taşıma arasındaki fark küçülür; Lowe ile Walmsley de fizyolojik sıcaklıkta taşıyıcının iki biçim arasında daha dengeli dağıldığını bildirir. Soğukta ölçülen yüz kat vücut sıcaklığına taşınamaz.

Cebin tanıdığı şekil

D-glukozun ayna eşinden ayrıldığını Kolaylaştırılmış Difüzyon dersinde görmüştük; Drew ile arkadaşlarının derlemesine göre GLUT'lar taşıdıkları şekerlerin stereoizomerlerini bile tanımaz. Aynı derleme, dışa açık biçimden hapsedilmiş biçime geçişin korunmuş bir yan zincirin glukozun iki hidroksiline uzanmasıyla başladığını aktarır. Derlemeye göre bu taşıyıcılar seçicidir ama şekerlerini zayıf bağlar; yüksek akı buna dayanır, çünkü sıkı tutan bir cep yükünü geç bırakırdı.

Aynı katlanma, üç iş

Tek yönlü taşıyıcıyı ve Aktif Taşıma dersindeki eşyönlü (symport) ile karşıt yönlü (antiport) taşımayı hatırlayalım; Wikipedia'nın MFS maddesi ailede üçünü de sayar: tek yönlü geçiş, protonla ya da sodyumla birlikte geçiş ve iki maddenin yer değiştirmesi. Deng ekibinin 2014 yazısı da GLUT1'i protonla eşleşen bakteriyel ksiloz taşıyıcısı XylE ile karşılaştırır. Katlanma aynı kalır, eşleşme değişir. İkincil Aktif Taşıma dersi bu eşleşmeyi açacak.

Modelin sınırı

• Klasik taşıyıcı modeli alyuvar kinetiğinin tamamını açıklamaz. Carruthers ile arkadaşları bazı verilerin giriş ve çıkış yerlerini aynı anda var sayan sabit yerli modellerle daha iyi uyuştuğunu aktarır; Naftalin 2008'de asimetrik dönüşümlü modellerin enerji korunumuyla çeliştiğini savunmuştu.
• Kristal tek bir anın ortalamasıdır; ara biçimlerin sırası ve hızları kinetik ölçümlerden ve benzetimlerden çıkarılır.
• Kullandığımız bağıntı tek bir bağlanma yeri ve birbirinden bağımsız taşıyıcılar varsayar. Carruthers ekibi şekerlerin birden çok yere birlikte bağlandığını düşündüren bulguları aktarır; Naftalin'in önerdiği modelde de dış ve iç yüzde iki sabit bağlanma yeri vardır.
• Hız sabitleri çoğunlukla soğukta ölçülmüştür. Vücut sıcaklığındaki oranlar daha küçüktür ve kaynaklar dış ve iç yüzün şekere ilgisi konusunda bile ayrışır.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Kesedeki Vmax ve Km bir kişinin kan şekerini ya da hücrelerinin glukoz alımını söylemez. Şekerin hücreye girişini "hızlandırdığı" ya da "engellediği" söylenen bir ürünün, besinin veya takviyenin iddiası, keselerde çizilen bu döngüden destek alamaz.

Dört durumlu çember

Öğleye doğru Arın kâğıdın arkasına dört durumlu bir çember çiziyor; yüklü yolu kalın, boş dönüşü ince bir okla gösterip incenin yanına "0,726" yazıyor. "Kapı kalabalıkta kapanmıyor," diyor. "Boş dönmek zorunda kalmıyor."

Selvi Hanım çemberin ortasına "10 ns / 0,83 ms" yazıyor. "Kanal bir yol açıyor," diyor. "Taşıyıcı her molekül için kendini baştan kuruyor." Arın "İ + GLUT1" şişesini buzdolabına koyarken arka rafta "İ + Na⁺/K⁺" etiketli bir şişe ve bir kutu ATP görüyor. Selvi Hanım kapağa yeni bir not yapıştırıyor: "Çarşamba. Bu kez yokuş yukarı."

Kendini sına

1. Vmax 75 birim, Km 5 milimol/L olsun. Glukoz 5, 10 ve 45 milimol/L'deyken giriş hızı kaç birimdir? 10'daki oran neden 2/3'tür?
2. i = G × (V − E) bağıntısı GLUT1'e neden uygulanamaz? Hapsedilmiş durumu kullan.
3. Doyma hızı saniyede 6.000 glukoz olan bir kesede, saniyede 1.200 devir yapan kaç taşıyıcı çalışır?
4. Boş ve yüklü taşıyıcı aynı hızda dönseydi dolu keselerde hızlanmış değiş-tokuş görülür müydü?
5. Km'si 2 milimol/L olan keselere ayrışma sabitinin iki katı derişimde maltoz eklenirse görünür Km ne olur? 4 milimol/L glukozda hız maltozsuz değerin kaçta kaçına iner?

Bir sonraki derse köprü

Jardetzky'nin notu, başlığının dediği gibi, zar pompaları için yazılmıştı. Aktif Taşıma dersinde Na⁺/K⁺ pompasını ve ATP hidrolizinden aldığı enerjiyi tanımlamıştık; bu derste aynı dönüşümlü erişim döngüsü yalnız derişim farkının yönüne işledi. Birincil Aktif Taşıma dersinin sorusu: ATP hidrolizi döngünün hangi adımına bağlanır ki P tipi ATPaz denen pompalar kendilerini geçici olarak fosforlayıp bağlanma yerinin hem yüzünü hem iyona ilgisini değiştirerek iyonu yokuş yukarı taşıyabilsin?