Zar Asimetrisi

Salı, dört kuyucuk

Salı, öğleye yirmi var. Gece esen poyraz incirin altına son meyveleri dökmüş; avluda arılar ezik incirlerin üstünde dolanıyor. Nezihe Hanım tezgâha dört kuyucuklu, cam tabanlı bir kap koyuyor. Birinci kuyucukta dünkü tarife benzeyen dev keseler var, ama karışıma bu kez fosfatidilserin de katılmış. İkincide sağlam kültür hücreleri duruyor. Üçüncüdeki hücrelerin zarı hafif bir deterjanla delinmiş. Dördüncüdekiler on dakika önce hücre içine kalsiyum sokan bir maddeyle karşılaşmış.

Her kuyucuğa aynı iki boya damlatılıyor: yeşil ışıyan işaretli bir protein ve zardan geçemeyen kırmızı bir DNA boyası. Batu sırayla bakıyor. Kesenin kenarı yemyeşil bir halka. Sağlam hücrelerde ne kontur var ne çekirdek, ekran neredeyse kara. Delinmiş hücrelerin hem kenarı yeşil hem çekirdeği kırmızı. Dördüncü kuyucukta kenar yine yeşil, ama çekirdekler karanlık. Batu başını kaldırıyor: "İki yüzü ayrı ayrı boyayacaktık." Nezihe Hanım gülümsüyor: "Boyadık bile. Yeşil boya zarı geçemez, yalnız önüne çıkanı görür."

Bu derste ne olacak

Plazma zarının iki yaprağında hangi lipitlerin toplandığını, bu farkın ilk kez nasıl ölçüldüğünü göreceğiz. Sonra farkı kuran ve bozan üç enzim ailesini, iç yaprağın yükünü ve fosfatidilserin dışarı çıktığında komşu hücrelerin bundan ne okuduğunu izleyeceğiz. Son olarak yeşil boyanın bir ölçüm olarak neyi gösterip neyi göstermediğine bakacağız.

Metin

İki yaprak, iki karışım

Fosfolipit çift tabakayı işlediğimiz derste dört baş grubunu adıyla anmıştık: fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin ve sfingomiyelin. Hepsi aynı zarın içindedir, ama aynı yaprakta değil.

Lipit çift tabakası üzerine yazılmış Wikipedia maddesi insan alyuvarının iç yaprağını çoğunlukla fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinozitol ve onun fosforlanmış türevlerinden kurulu sayar; dış yaprağın temelinde fosfatidilkolin, sfingomiyelin ve çeşitli glikolipitler vardır. Lorent ile arkadaşları 2020'de Nature Chemical Biology'de aynı tabloyu kütle spektrometrisiyle yeniden çizdiler. Bütün alyuvarları yalnız dış yaprağa erişebilen enzimlerle işlediler: sindirilen lipit dışta, dokunulmadan kalan içte sayıldı. Fosfatidiletanolamin ve fosfatidilserin neredeyse hiç sindirilmedi; fosfatidilinozitol de içte kaldı. Sfingomiyelini parçalayan enzim ise bu lipidin büyük kısmını yıktı. Dış yaprak neredeyse yalnız fosfatidilkolin ile sfingomiyelinden oluşuyordu.

Lipit salları dersinde sfingomiyelinin kolesterolle düzenli adacıklar kurduğunu görmüş, Batu'nun "iki yaprağa aynı oranda mı koydunuz" sorusunu açık bırakmıştık. Cevap buradadır: hücrede sfingomiyelin dış yaprakta toplanır. Glikokaliks dersinde şeker zincirlerinin endoplazmik retikulumun ve Golgi'nin boşluğunda eklendiğini, bu boşluğa bakan yüzün kesecik kaynaşınca hücrenin dışına döndüğünü öğrenmiştik. Van Meer'in 2011 derlemesi aynı mantığı lipitlere uygular: gliserolipitler çoğunlukla sitozole bakan yüzde, sfingolipitler öbür yüzde sentezlenir. Çift tabaka maddesi de sfingomiyelinin dış yaprakta sentezleniyor göründüğünü yazar. Asimetrinin bir kısmı, lipidin doğduğu yüzün hatırasıdır.

Mark Bretscher 1972'de Nature New Biology'de biyolojik zarlar için asimetrik bir çift tabaka yapısı önerdi; Wikipedia'nın flippaz maddesi, asimetrinin etkin olarak korunabileceğini 1970'lerin başında onun öngördüğünü yazar. Verkleij ile arkadaşları ertesi yıl Biochimica et Biophysica Acta'da insan alyuvarını fosfolipazlarla ve dondurup aşındırarak çekilen elektron mikroskobu görüntüleriyle incelediler. Lorent ile arkadaşları bu çalışmayı sınıfların alyuvar ve trombositlerdeki klasik ölçümleri arasında anar ve kendi dağılımlarının bu eski kestirimlerle uyuştuğunu yazar.

Yük ve hesap

Fosfatidilserinin baş grubu net bir eksi yük taşır. Lorent ile arkadaşları onu eksi yüklü ve neredeyse yalnız iç yaprakta bulunan lipit diye tanıtır; Hücre zarını anlatan Wikipedia maddesine göre ise eksi yüklü fosfatidilserini iç yüzde toplayan flippazlar ve scramblazlardır. Zarın sitozole bakan yüzü eksi yüklü bir zemindir; dış yüzde kolin başları yüksüzdür.

Kurgu bir zarda fosfatidilserinin toplam lipidin yüzde sekizi olduğunu varsayalım. İki yaprakta aşağı yukarı eşit sayıda lipit varsa ve fosfatidilserinin hepsi içteyse, iç yapraktaki payı iki katına çıkar: 2 × 0,08 = 0,16. Çift tabaka dersinde tek bir lipidin yayıldığı yüzeyi 0,65 nm² olarak kullanmıştık. Bir mikrometrekare 10⁶ nm² eder; 10⁶ ÷ 0,65 ≈ 1,54 milyon lipit tek bir yaprağın o alanını doldurur. Bunların 0,16 × 1,54 milyon ≈ 246.000'i fosfatidilserindir. Bir fosfatidilserine 0,65 ÷ 0,16 ≈ 4,1 nm² düşer; karekökü yaklaşık 2 nm eder. İç yüzde her iki nanometrede bir eksi yük bulunur. Dış yaprakta ise hiç yoktur.

Batu'nun ilk kuyucuğundaki kese farklıdır. Fosfatidilserin karışıma baştan katıldığı için iki yaprağa rastgele dağılmıştır. Kurgu kesenin yarıçapı 5 µm, zar kalınlığı yaklaşık 4 nm olsun. Dış yüzün alanının iç yüzünkine oranı (5.000 ÷ 4.996)² ≈ 1,0016'dır; binde iki bile etmeyen bir fark. Fosfatidilserinin yarısı dışarıdadır ve yeşil halka bu yarıdan gelir.

Kuran, koruyan, bozan

Enine geçişi zar akışkanlığı dersinde tanımlamış, su seven başın yağlı çekirdeği aşmak zorunda kaldığı için bu yolculuğu kendiliğinden pek seyrek yaptığını görmüştük. Bu yavaşlık asimetriyi mümkün kılar: bir kez kurulan fark kolay kolay dağılmaz. Farkı kuran da enzimlerdir. Wikipedia'nın flippaz maddesi taşıyıcıları üç sınıfa ayırır; van Meer'in derlemesi de aynı üçlüyü anar.

Aktif taşıma dersinde (L02-P07-M01-D06) enerjiyi doğrudan ATP hidrolizinden alan pompaları birincil aktif taşıma diye adlandırmıştık. Flippaz da böyle çalışır. Palmgren ile Nissen'in 2011 derlemesi P tipi ATPazları katyon ve lipit pompalarından oluşan büyük bir üst aile sayar; Wikipedia'daki P tipi ATPaz maddesi de bu ailenin çoğu üyesinin katyon taşıdığını, bir alt ailenin, flippazların, fosfolipitleri çevirdiğini yazar. Pompaların nasıl döngü kurduğunu modülün birincil aktif taşıma dersinde ayrıntısıyla göreceğiz.

Floppaz adının arkasında bir çekince vardır. Deppe ile arkadaşlarının 2018 çalışması ABC taşıyıcılarının fosfolipitleri tercihen sitoplazmik yapraktan dış yaprağa taşıdığını ve bu yüzden floppaz diye anıldığını yazar. Van Meer ise aynı taşıyıcıların çoğunun lipidi öbür yaprağa bırakmaktan çok hücrenin dışına aktardığını not eder. İki kaynak yön konusunda anlaşır; mekanizmanın ne kadar yaprak çevirme olduğu konusunda anlaşmaz.

Wikipedia'nın scramblaz maddesi etkinliğin enerji gerektirmediğini ve sitozoldeki kalsiyum yükselince başladığını yazar. Lorent ile arkadaşları scramblazları lipitlerin derişim farkı boyunca aktığı kanallar diye tanımlar. Bevers ile Williamson iki proteinin kimliğini öne çıkarır: kalsiyumla düzenlenen TMEM16F ve kaspazlara duyarlı XKR8. Suzuki ile arkadaşları 2010'da Nature'da bir fare hücre dizisini kalsiyumu içeri sokan bir maddeyle işleyince fosfatidilserinin dışa çıktığını ve bunun için TMEM16F'nin gerektiğini gösterdi. Batu'nun dördüncü kuyucuğu bu deneyin kurgudaki eşidir.

Dış yüzde fosfatidilserin: beni ye

Tek hücreden çok hücreliye geçişi anlattığımız derste apoptozu programlı hücre ölümü diye tanımlamış, ayrıntısını ilerideki derslere bırakmıştık. Zar bu sürecin en erken işaretlerinden birini taşır. Fadok ile arkadaşları 1992'de makrofajların apoptoza giren lenfositlerin dış yüzüne çıkmış fosfatidilserini tanıyıp onları yuttuğunu bildirdiler; fosfatidilserinli lipozomlar bu yutmayı engelliyor, başka eksi yüklü lipitlerden yapılanlar engellemiyordu. Serbest radikaller dersinde fagositlerin yuttuğunu nasıl öldürdüğünü görmüştük; burada aynı hücreler neyi yutacaklarını zardan okur.

Nagata ile arkadaşlarının 2016 derlemesi dışarı çıkmış fosfatidilserini ölü hücrenin üzerindeki bir "beni ye" (eat me) işareti diye adlandırır. Wikipedia'nın efferositoz maddesi de ölen hücrelerin canlılardan bu işaretle ayrıldığını yazar. İşaretin kendisi yeni bir molekül değildir; hep orada olan bir lipidin yanlış yüze geçmesidir.

Dış yüzde fosfatidilserin: pıhtı

Aynı işaret başka bir yerde yaşamla ilgilidir. Nagata ile arkadaşlarının derlemesine göre etkinleşen trombositlerde dışa çıkan fosfatidilserin pıhtılaşma faktörlerine bir iskele kurar. Wikipedia'nın trombosit maddesi, etkinleşen trombositin yüzeyinin eksi yüklendiğini, scramblazın eksi yüklü fosfolipitleri dışa taşıdığını ve bu lipitlere pıhtılaşma zincirinin iki enzim kompleksinin bağlandığını yazar; bağlanma kalsiyum ister. Suzuki ile arkadaşları, fosfolipit karıştırması kusurlu olan Scott sendromlu bir hastada TMEM16F geninde bir mutasyon buldular.

Yeşil boyanın okuduğu

Batu'nun yeşil proteini anneksin V'tir. Koopman ile arkadaşları 1994'te floreseinle işaretlenmiş anneksin V'in fosfatidilserine bağlanmasını apoptotik hücreleri akış sitometrisiyle saptamak için kullandılar. Vermes ile arkadaşları ertesi yıl proteinin fosfatidilserine kalsiyuma bağlı ve yüksek eğilimle tutunduğunu yazdılar. Floresans dersinde (L02-P07-M04-D03) floreseinin suda 494 nanometre dolayında soğurduğu ışığı 512 nanometre dolayında, yeşil olarak geri verdiğini görmüştük; kuyucuktaki halka o salımdır.

Yöntemin bir kör noktası vardır. Vermes ile arkadaşları fosfatidilserinin dışa çıkmasının apoptoza özgü olmadığını, nekrozda da görüldüğünü vurgular. Fark zardadır: apoptozun başında zar sağlamdır, nekrozda delinir. Bu yüzden anneksin bağlanması zardan geçemeyen bir boyayla birlikte okunmalıdır. Batu'nun üçüncü kuyucuğu tam bu tuzağı gösterir: yeşil boya delikten girip iç yaprağa ulaşmış, dış yüzde hiç fosfatidilserin olmadığı hâlde kontur yeşil görünmüştür. Kırmızı çekirdek, yeşilin hangi yüzden geldiğini söyler. Wikipedia'nın anneksin A5 maddesi de proteini nicel olmayan bir sonda sayar.

Proteinler de yön bilir

Asimetri yalnız lipitlerin özelliği değildir. Zar proteinleri dersinde GPI çapalı proteinleri anmış, çapaların yönünü sonraya bırakmıştık: Yadeta ile arkadaşları ve Wikipedia'nın GPI maddesi bu proteinleri zarın dış yüzüne yerleştirir. Glikokaliks dersinde şekerlerin yalnız dış yüzde durduğunu görmüştük. Bir zarın iki yüzü, içindeki her molekül için ayrı birer adrestir.

Dördüncü kuyucuk

Batu defterin boş sayfasını dört satıra bölüyor: "1: iki yüz, kese", "2: dış yüz, boş", "3: iç yüz, delik", "4: dış yüz, dolu, delik yok". Altına "0,16 → 2 nm" yazıyor; dördüncü satırın ucunu ise bir soru işaretiyle açık bırakıyor.

"Bu hücreler ölüyor mu?" Nezihe Hanım kuyucuğun kapağını kapatıyor. "Kalsiyumu ortamdan çekersen yeşil söner mi, ona bak. Sönerse hücre hâlâ kendi zarını yönetiyordur; bir şey olmuş ve hücre bunu duymuş." Batu kırmızı boyası olmayan dördüncü kuyucuğa bir kez daha bakıyor. Zar delinmemiş; ama bir şey içeri haber vermiş.

Kendini sına

1. Bir hücreyi yalnız dış yaprağa erişen bir enzimle işliyorsun. Fosfatidilkolin kısmen, sfingomiyelin büyük ölçüde sindiriliyor, fosfatidilserin hiç sindirilmiyor. Bu sonuç yapraklar hakkında ne söyler, hangi varsayıma dayanır?
2. Enine geçiş kendiliğinden hızlı olsaydı flippazların işi nasıl değişirdi? Asimetri korunabilir miydi?
3. Flippaz, floppaz ve scramblazı yön, enerji kaynağı ve asimetriye etkisi bakımından karşılaştır.
4. Kurgu bir zarda fosfatidilserin toplam lipidin yüzde altısı olsun ve tamamı içte dursun. İç yapraktaki payı ne olur? Scramblaz dengeyi tam kurduğunda her yapraktaki pay kaça iner?
5. Anneksin V ile yeşil boyanmış, kırmızı DNA boyasıyla çekirdeği de boyanmış bir hücre gördün. Neden bu hücrenin fosfatidilserini dışarı çıkardığı sonucuna hemen varamazsın?
6. Apoptotik fosfatidilserin çıkışı için ATP'nin tükenmesi neden yeterli bir açıklama değildir? Hangi iki deney bunu gösterdi?

Bir sonraki derse köprü

Dördüncü kuyucuktaki hücrelerin zarı sağlamdı; kırmızı boya içeri girmedi, ama hücre içi kalsiyum yükselince zar kendi yüzlerini yeniden düzenledi. Zar bütünlüğünü ve hücresel sinyali işleyecek ders bu boşluğu soracak. Zar delinmeden dışarıdaki bir işaret içeriye nasıl ulaşır? Dış yüzdeki bir reseptör ile sitozol arasındaki boşluğu kalsiyum gibi bir ikincil haberci mi doldurur? İç yaprakta toplandığını gördüğümüz fosfoinozitoller bu habercilerin kaynağı olabilir mi, ve bir zarın "bütün" sayılması için yalnız delinmemiş olması yeter mi?