Lipit Salları

Pazartesi, iki renkli keseler

Pazartesi sabahı dokuzu kırk geçiyor; hafta sonu esen rüzgâr avludaki incirin yapraklarını sararttı. Nezihe Hanım iki tüp getiriyor. Birincisindeki dev keseler üç lipitten hazırlanmış: doymamış kuyruklu bir fosfatidilkolin, sfingomiyelin ve kolesterol. İkincisinde sfingomiyelin yok, öbür ikisi aynı. İki tüpe de iki boya katılmış: kırmızı işaretli bir lipit ve yeşil ışıyan başka bir işaret.

Batu birinci tüpten bir damlayı mikroskoba koyuyor. Kesenin yüzü tek renk değil; kırmızı bir denizde yuvarlak yeşil adacıklar yüzüyor. Adacıklar yavaşça sürükleniyor, ikisi çarpışınca tek bir büyük adacığa dönüşüyor. İkinci tüpün keseleri baştan sona düz, soluk bir renkte. Batu gözünü okülerden ayırmadan cuma günkü koyu noktaları hatırlatıyor: "Onlar bunlar mı?" Nezihe Hanım omuz silkiyor: "Kesede bunları herkes görür. Hücrede görmek başka iş."

Bu derste ne olacak

Kesedeki adacıkların hangi lipitlerden kurulduğunu ve neden ayrıştığını göreceğiz. Sonra aynı fikrin hücre zarına taşınmasını, lipit salı hipotezini izleyeceğiz: onu destekleyen ilk yöntemi, o yöntemin eleştirisini, tanımın nasıl değiştiğini ve canlı hücrede ölçmenin neden bu kadar güç olduğunu.

Metin

Kesede iki sıvı

Kolesterolün zar işlevini işlediğimiz derste sıvı-düzenli fazı tanımlamış, iki akışkan fazın tek bir zarda bir arada durup duramayacağı sorusunu bu derse bırakmıştık. Batu'nun keseleri o yan yanalığın kendisidir.

Wikipedia'nın sfingomiyelin maddesi bu lipidin hidrofobik zincirlerinin öbür fosfolipitlerinkinden çok daha doymuş olduğunu ve ana geçiş sıcaklığının benzer fosfolipitlerden yüksek olduğunu yazar. Zar akışkanlığı dersinde uzun ve düz kuyrukların geçiş sıcaklığını yükselttiğini görmüştük; sfingomiyelin bu yüzden yüksek erime noktalı tarafa düşer. Doymamış fosfatidilkolinin dirsekli kuyrukları ise oda sıcaklığında çoktan erimiştir.

Veatch ile Keller 2003'te Biophysical Journal'da bu tür karışımları sistemli biçimde taradılar. Yüksek erime noktalı doymuş bir lipit, düşük erime noktalı doymamış bir lipit ve kolesterolden kurulan uzun bir karışım listesi dev keselerde sıvı alanlar oluşturdu. Bir faz doymamış lipitçe, öbürü doymuş lipit ve kolesterolce zengindi. Aynı ilişki fosfatidilkolinler ve sfingomiyelinler için geçerliydi. Sıcaklığı yükselterek ya da keseden kolesterol çekerek faz sınırını aştılar; alanlar o zaman kayboldu.

Dietrich ile arkadaşlarının 2001 çalışması eşit oranda fosfolipit, kolesterol ve sfingomiyelin kullandı. Özetlerine göre desteklenmiş lipit katmanlarında çapı birkaç mikrometre olan alanlar oluştu; yalnız fosfatidilkolin ve kolesterolden kurulan karışım düz kaldı. İki faz da akışkandı ve işaretli sonda iki faz arasında gidip gelebiliyordu; soğutup ısıtınca alanlar kurulup dağıldı. Batu'nun sfingomiyelinsiz tüpü bu karşılaştırmanın kurgudaki eşidir.

Hücresel bölmelendirme dersinde zarsız bölmeleri anlatırken faz ayrışmasına (phase separation) değinmiştik: bir karışımın bileşenleri iki ayrı faza ayrılabilir. Burada ayrışan şey iki boyutlu bir sıvıdır. Wikipedia'nın lipit salı maddesi de bu ayrışmayı suyun yüzeyindeki yağ damlalarına benzetir ve iki fazı sıvı-düzenli ile sıvı-düzensiz diye adlandırır.

Hipotez: zarda yüzen sallar

Fikrin kökü hücrenin içindeki trafiktir. Wikipedia'nın lipit salı ve sfingolipit maddelerine göre sal kavramı ilk olarak zar taşınımını, yani lipitlerin ve proteinlerin Golgi'den plazma zarına giderken ayıklanmasını açıklamak için önerildi. Brown ile Rose 1992'de Cell'de yayımladıkları çalışmada, epitel hücrelerinde GPI çapalı bir proteinin deterjanda çözünmeyen, glikosfingolipitçe zengin ve düşük yoğunluklu bir kesimle birlikte ayrıldığını buldular; özetleri bu bulguyu Simons ile arkadaşlarının hücrenin tepe yüzüne proteinleri ayıklama modeline destek sayar. Zar proteinleri dersinde GPI çapasını lipit çapalarından biri olarak görmüştük.

Simons ile Ikonen hipotezi 1997'de Nature'da açık biçimde kurdu; Wikipedia'nın maddesi de fikrin bu makaleyle biçimlendiğini yazar. Özetlerine göre sfingolipitler ve kolesterol dinamik olarak kümelenip akışkan çift tabakanın içinde hareket eden sallar oluşturur; bu sallar zarlar hücre içinde taşınırken ve sinyal iletiminde proteinlerin tutunacağı platformlar işlevi görür.

Deterjanla ölçmek

Zar proteinleri dersinde deterjanın zarı dağıttığını ve integral proteinleri misellere aldığını görmüştük. Sal çalışmalarının ilk yıllarında aynı araç ölçüm yöntemine dönüştü. Wikipedia'ya göre hücreler Triton X-100 gibi iyonik olmayan bir deterjanla buz soğuğunda işlenince zarın bir kısmı çözünmeden kalır.

Heerklotz'un 2002 çalışması bu özdeşliği doğrudan sınadı. Eşit oranda fosfatidilkolin, yumurta sfingomiyelini ve kolesterolden yapılmış keselere artan miktarda Triton ekleyip farklı sıcaklıklarda ısıl geçişleri izledi. Sonuç, deterjanın homojen, akışkan bir zarda düzenli alanlar yaratabildiğini gösterdi; bu alanlar sonradan deterjana dayanıklı çıkıyordu. Heerklotz deterjana dirençli zarın biyolojik sallara boyutta, yapıda, bileşimde, hatta varlıkta benzetilmemesi gerektiğini yazdı. Lichtenberg, Goñi ve Heerklotz 2005'te sal, deterjana dirençli zar ve sıvı-düzenli fazın üç ayrı kavram olduğunu, literatürde birbirine karıştırıldığını vurguladılar. Kraft'ın 2013 derlemesi de bu kesimleri hücre parçalanmadan önce bulunmayan yapay yapılar sayar.

Ölçüm biliminin ilk dersinde, ölçülen büyüklüğü tanımlarken (L02-P08-M01-D01) yöntem tanımlı ölçülen büyüklüğü görmüştük: sonucu prosedürün kendisi belirler ve prosedür değişince ölçülen büyüklük de değişir. Deterjana dirençli kesim bunun ders kitabı örneğidir. Heerklotz'un gördüğü faz sırası deterjan miktarına ve sıcaklığa bağlıydı; Wikipedia da bu yolla ayrılan lipit ve proteinlerin belirsizliğini not eder. Ölçülen şey hücredeki bir yapı değil, bir işlemin kalıntısıdır.

Tanım değişiyor

Sal çalışmaları 2006'da Keystone sempozyumlarından birinin konusu oldu. Pike'ın aynı yıl Journal of Lipid Research'te yayımladığı raporuna göre toplantıdan bir uzlaşı tanımı çıktı: zar salları küçük (10–200 nm), heterojen, çok dinamik, sterol ve sfingolipitçe zengin, hücresel süreçleri bölmelere ayıran alanlardır; küçük sallar protein etkileşimleriyle zaman zaman daha büyük platformlar kurabilir. Wikipedia'nın maddesi aynı tanımı aynı boyut aralığıyla aktarır.

Simons ile Ikonen de kümelenmeyi dinamik saymıştı; yeni olan, boyutun açıkça küçük bir aralığa bağlanması ve heterojenliğin tanıma girmesidir. Wikipedia'ya göre 2006'ya gelindiğinde deterjana dirençli kesimlerin hücrede önceden var olan sallardan farklı olduğu gösterilmiş, model büyük bir revizyon geçirmişti. Aynı madde hipotezin çelişkili kanıtlar karşısında defalarca yeniden tanımlandığını yazar; Kraft da tanımın gözden geçirildiğini not eder. Ölçüm biliminin o ilk dersinde tanımsal belirsizliği de kurmuştuk: tanım ne kadar az ayrıntı taşırsa, en iyi cihaz bile o kadar geniş bir belirsizliğin altına inemez. Sal tartışmasında bu tablo büyük ölçekte görülür. Bir laboratuvar nanometre ölçeğinde ve göz açıp kapayıncaya kadar süren bir tutulmayı, bir başkası mikrometre ölçeğinde bir yamayı "sal" diye adlandırırsa, iki sonuç aynı büyüklüğün ölçümü olmayabilir.

Bir salda kaç lipit var

Fosfolipit çift tabaka dersinde bir lipidin kapladığı alanı 0,65 nm² saymıştık. Tanımın alt ucunda, çapı 10 nm olan yuvarlak bir alanın yarıçapı 5 nm'dir; alanı π × 5² ≈ 78,5 nm² eder. 78,5 ÷ 0,65 ≈ 121 lipit bir yaprağa, yaklaşık 240 lipit iki yaprağa sığar. Üst uçta çap 200 nm, yarıçap 100 nm'dir: π × 100² ≈ 31.400 nm², 31.400 ÷ 0,65 ≈ 48.300 lipit bir yaprakta, iki yaprakta yaklaşık 96.700. Düzenli fazda lipitler daha sıkı paketlendiği için gerçek sayı biraz büyüktür; mertebe değişmez. Tanımın aralığı, birkaç yüz lipitlik bir kümeden yüz bine yakın lipitlik bir alana uzanır.

Aynı sayıları mikroskopla karşılaştıralım. Abbe'nin sınırını hücre kuramının tarihini anlattığımız derste hesaplamıştık: 500 nanometrelik ışıkla, objektifin sayısal açıklığına göre 180 ile 250 nanometre arasında bir değer çıkmıştı. 180 ÷ 10 = 18, 250 ÷ 10 = 25: en küçük sal sınırın on sekizde biri ile yirmi beşte biri kadardır. Tanımın üst ucu sınırın hemen çevresindedir; 200 nanometrelik bir salın içi en iyi objektifte bile seçilmez, olsa olsa tek bir leke görünür. Alan oranıyla, çapı 200 nanometre olan bir lekeye 10 nanometrelik alanlardan (200 ÷ 10)² = 400 tanesi düşer. Batu'nun kesesindeki adacıkların kurgu çapı 5 µm'dir; 5 ÷ 0,2 = 25, sınırın yirmi beş katı.

Canlı hücreye bakmak

Wikipedia'nın maddesi tartışmanın başlıca nedenini canlı hücrede sal incelemenin güçlüğüne bağlar: 10–200 nanometrelik alanlar klasik kırınım sınırının altındadır. Eggeling ile arkadaşları 2009'da Nature'da çıkan STED gözlemlerinin özetinde aynı güçlüğü anlatır; bildirilen boyutlar bir protein kompleksinin büyüklüğü ile optik çözünürlüğün sınırı arasındadır.

Bu engeli aşmak için iki yol denendi. Tek molekül izlemede zardaki tek tek işaretli moleküllerin yolu kaydedilir; Wikipedia bu yöntemin zarda çitleri, engelleri ve tutulma noktalarını ortaya çıkarabildiğini yazar. İkincisi süper çözünürlük mikroskobudur. Eggeling ile arkadaşları canlı hücrenin zarında, uyarılmış salım azaltmalı (STED) mikroskopla gözlem alanını kırınım sınırının çok altına küçülttüler. Sfingolipitlerin ve GPI çapalı proteinlerin kolesterole bağlı biçimde çok kısa süre çok küçük alanlarda tutulduğunu gördüler. Kraft da bu bulguyu tek molekül izlemeyle alınan benzer sonuçlarla birlikte sal hipotezine uyan veriler arasında sayar.

Kanıtın göstermediğini de aynı kaynaklar söyler. Kraft'a göre kolesterolü hücreden çekmek hücre iskeletinin aktin ağını da bozar; Wikipedia da kolesterol boşaltıldıktan sonra kaybolan bir işlevin yalnız salların dağılmasına bağlanamayacağını yazar. Kraft başka bir açıklamaya da yer verir: zarın altındaki aktin ağı ve ona bağlı proteinler zarı bölmelere ayırıp bileşimi farklı alanlar kurabilir. Munro 2003'te Cell'de, canlı hücredeki doğrudan çalışmaların salların boyutu ve hatta varlığı konusunda uzlaşmaya varmadığını yazmıştı. Levental ile arkadaşları 2020'de ilkenin fizik ve kimyasının iyi anlaşıldığını, hücrede varlığının ve öneminin ise hâlâ aydınlatılmadığını belirtir.

Adacıklar birleşirken

Batu defterin sayfasını dikey bir çizgiyle bölüyor. Solun başına "kese: 5 µm, gözle", sağın başına "hücre: 10–200 nm, sınırın altında" yazıyor. Altına "121 / 48.300, bir yaprak" ekliyor. Mikroskopta iki yeşil adacık daha birleşiyor.

Batu kalemi bırakıyor: "Bu kesede sfingomiyelini iki yaprağa aynı oranda koydunuz, değil mi?" Nezihe Hanım başını sallıyor. "Hücre öyle yapmaz. Yarın bir kesenin iki yüzünü ayrı ayrı boyayacağız."

Kendini sına

1. Batu'nun iki tüpü arasındaki tek fark sfingomiyelindir. İkinci tüpün keseleri neden düz kaldı? Kolesterol de çekilseydi birinci tüpte ne beklerdin?
2. Sıvı-düzenli fazdaki bir lipit ile sıvı-düzensiz fazdaki bir lipit arasında zincir düzeni ve yanal difüzyon bakımından ne fark vardır?
3. Deterjana dirençli zar neden yöntem tanımlı bir büyüklüktür? Heerklotz'un bulgusu bu kesimle sal arasındaki bağı nasıl zayıflatır?
4. Çapı 50 nm olan bir sal düşün. Her lipit 0,65 nm² kaplıyorsa iki yaprakta kaç lipit taşır? 180 nanometrelik bir sınırdan kaç kat küçüktür?
5. Kolesterolü çekilen bir hücrede bir sinyal yolu duruyor. Bu gözlem salların o yoldaki rolünü kanıtlar mı? Başka hangi açıklamayı dışlamak gerekir?
6. 1997 hipotezi ile 2006 tanımını karşılaştır: salın boyutu, heterojenliği ve deterjana dirençli kesimle ilişkisi konusunda ne değişti, ne aynı kaldı?

Bir sonraki derse köprü

Yapay keseler iki yaprağı aynı karışımla kurar; Wikipedia'nın lipit salı maddesi de model zarların doğal asimetriden yoksun olduğunu eksiklikleri arasında sayar. Zar Asimetrisi dersi bu eksiğin hücrede neyi değiştirdiğini soracak. Zar akışkanlığı dersinde enine geçişin kendiliğinden çok yavaş olduğunu, hücrelerin bu yavaşlığı flippaz denen enzimlerle aştığını görmüştük. O hâlde iç ve dış yaprak nasıl farklı lipitlerle dolar, sfingomiyelin hangi yaprakta toplanır ve fosfatidilserin gibi bir lipit dış yaprağa geçtiğinde çevresindeki hücrelere ne bildirilmiş olur?