Floresans

Açılış sahnesi

Aynı haftanın çarşamba akşamı, Niğde. Optik laboratuvarında tavan lambaları kapalı, perdeler yine çekili. Tezgâhın ortasında küçük bir morötesi lamba duruyor; tüpüne doğrudan bakınca yalnız soluk bir mor görülüyor. Lambanın önüne üç şey dizilmiş: marketten alınmış bir şişe tonik, damlalıklı cam bir şişede sarıya çalan bir boya çözeltisi ve Tunç'un küçük kardeşinin tavanından sökülmüş, karanlıkta parlayan plastik yıldızlar.

Selda Hanım lambayı yakınca toniğin içi soluk mavi bir ışıkla doluyor, boya şişesi ise parlak bir yeşille parıldıyor. Tunç lambanın morundan toniğin mavisine, oradan boyanın yeşiline bakıp duruyor. Selda Hanım düğmeyi kapatıyor: tonik ile boya aynı anda kararıyor, yıldızlar ise dakikalarca yeşilimsi bir ışık vermeyi sürdürüyor.

"Dün tahtaya bir soru yazmıştım," diyor Tunç. "Işığı geri veren molekül hangi renkte ışık verir diye. Görünen o ki gelenden başka bir renkte, hep kırmızı uca doğru. Peki neden o yöne kayıyor, ve yıldızlar neden hâlâ yanıyor?"

Bu derste ne olacak

Soğurulan bir fotonun enerjisinin ışık olarak dışarı çıktığı yolu izleyeceğiz. Uyarılmış bir molekülün geçtiği basamakları bir enerji diyagramında sıralayıp salınan ışığın neden daha uzun dalga boyunda çıktığını gösterecek, kaybolan enerjiyi elektronvolt olarak hesaplayacağız. Floresansı fosforesanstan ayıran zaman ölçeğini karşılaştıracak, kuantum verimini tanımlayacak ve floresans mikroskobunun bu renk farkını nasıl kullandığını göreceğiz.

Metin

Geri verilen ışık

Soğurma ve Saçılma dersinde uyarılmış bir molekülün enerjisinin çoğu zaman ışımasız yollarla ısıya dağıldığını görmüştük; termometrenin siyah boyası bunun örneğiydi. Bazı moleküllerde ise bu enerjinin bir kısmı yeniden ışık olarak çıkar. Wikipedia'daki floresans maddesi, çıkan ışığın dalga boyunun soğurulanınkinden uzun, enerjisinin ise düşük olduğunu yazar. Salım uyarıcı ışık sürdükçe sürer ve ışık kesilince hemen biter; tonik şişesi lamba kapanınca bu yüzden karardı.

Toniğin parıltısı içindeki kininden gelir. Ansiklopedinin tonik su maddesi kinin moleküllerinin enerjiyi, daha sık görülen ısı yerine ışık olarak saldığını anlatır. David Harvey'in LibreTexts'te yayımlanan enstrümantal analiz kitabı da toniğin morötesi lambanın altında ışıdığını not eder ve kininin salım tayfını 350 nanometrelik uyarımla çizer; kinin maddesi soğurma tepesini aynı yerde verir. Bu fotonun enerjisi, Elektromanyetik Spektrum dersindeki 1239,84 sabitiyle 1239,84 ÷ 350 ≈ 3,54 eV eder.

Enerji merdiveni: Jablonski diyagramı

Hidrojen atomunda, Elektron Orbitalleri dersinde gördüğümüz gibi, iki düzey arasındaki fark tek bir fotonla karşılanıyordu. Molekülde tablo daha kalabalıktır, çünkü her elektron düzeyinin üstünde bir dizi titreşim basamağı yer alır. Bu basamakları ve aralarındaki geçişleri tek bir çizimde gösteren şemaya Jablonski diyagramı denir. Floresans maddesi diyagramı, uyarılmış moleküllerin gevşeme yollarının çoğunu anlatan çizim olarak tanıtır; Thermo Fisher'ın Molecular Probes el kitabındaki floresansa giriş bölümü de olayı aynı diyagramın üstünde uyarım, uyarılmış hâlde geçen süre ve salım diye üç evrede anlatır.

Foton yutulduğunda molekül üst elektron düzeyine, çoğu zaman o düzeyin yüksek bir titreşim basamağına çıkar. Fazlalık uzun kalmaz: molekül çarpıştığı çözücü moleküllerine titreşim enerjisi aktarır ve üst düzeyin en alt basamağına kayar. Harvey bu titreşimsel gevşemenin ortalama ömrünü 10⁻¹² saniyenin altında verir; ışık çıkmadan çok önce iş bitmiş olur. Harvey'in tanımıyla floresans, molekül bu en alt basamaktan alt elektron düzeyine bir foton salarak döndüğünde olur.

Foton alt düzeyin de çoğu zaman yüksek bir titreşim basamağına iner ve molekül oradaki fazlalığı yine çevresine bırakır. Böylece enerji iki ayrı yerde ısıya gider: yukarıda, uyarılmanın hemen ardından, ve aşağıda, salımın hemen ardından. Işık olarak çıkan pay ikisinin arasında kalan basamak farkıdır.

Kaybolan enerjinin adı

Stokes kayması bu kaybın tayftaki izidir. Wikipedia'nın Stokes kayması maddesi onu soğurma ve salım bantlarının tepeleri arasındaki fark diye tanımlar ve nedenleri arasında titreşimsel gevşeme ile çözücü moleküllerinin uyarılmış moleküle göre yeniden dizilmesini sayar. Thermo Fisher'ın el kitabı aynı farkı uyarım ve salım fotonlarının enerji farkı olarak verir. Kitap bu farkın, zayıf salım ışığını güçlü uyarım ışığından ayrı yakalamayı mümkün kıldığını da vurgular.

Ad, George Gabriel Stokes'tan gelir. Floresans maddesi, Stokes'un 1852'deki kırılabilirlik makalesinde bu görünüşe florit mineralinin İngilizce adından (fluor-spar) türettiği "floresans" sözcüğünü önerdiğini aktarır. İnternet Arşivi'ndeki kayıt makaleyi "On the Change of Refrangibility of Light" başlığıyla, Philosophical Transactions of the Royal Society of London'ın 142. cildinde, 1852 tarihiyle verir.

NADH ve floresein: iki kayma

NADH'ın 340 nanometre çevresindeki soğurma bandını ve yükseltgenmiş NAD⁺'da bu bandın bulunmadığını Elektron Taşıyıcılar dersinden biliyoruz. Ansiklopedinin NAD maddesi, sulu çözeltide serbest NADH'ın yaklaşık 335 nanometrede uyarıldığında 445–460 nanometre arasında mor-mavi bir ışık verdiğini, NAD⁺'nın ise floresans vermediğini yazar. Blacker ve arkadaşlarının 2014'te Nature Communications'ta yayımladığı çalışma değerleri daha geniş bantlarla verir: NADH'ın nikotinamid halkası 340 ± 30 nanometrede soğurur, 460 ± 50 nanometrede ışır. Kolenc ile Quinn'in 2019 tarihli otofloresans derlemesi de indirgenmiş taşıyıcıların ışıdığını, NAD⁺'nın ışımadığını belirtir.

Kaymayı enerjiyle ölçelim. Soğurma ve salım tepeleri nanometreyle verilir, ama aynı enerji farkı tayfın farklı yerlerinde farklı sayıda nanometreye karşılık gelir; karşılaştırma elektronvoltla daha anlamlıdır. 340 nanometrede foton 1239,84 ÷ 340 ≈ 3,65 eV taşır, 460 nanometrede 1239,84 ÷ 460 ≈ 2,70 eV. Aradaki 0,95 eV ışık çıkmadan ısıya gitmiştir; bu, yutulan enerjinin 0,95 ÷ 3,65 ≈ 0,26'sı, kabaca dörtte biridir. Salım tepesini ansiklopedinin alt ucu olan 445 nanometre alırsak foton 1239,84 ÷ 445 ≈ 2,79 eV taşır ve kayıp payı 0,24'e iner; sonuç bandın hangi noktasının seçildiğine az duyarlıdır.

İkinci örnek, açılıştaki şişenin boyası olan floreseindir. Wikipedia'nın floresein maddesi suda soğurma tepesini 494, salım tepesini 512 nanometre verir; Thermo Fisher'ın boya bölümü uyarım tepesini yine 494, salım tepesini tablosunda 514 nanometre olarak listeler. Hesap bu kez çok farklı çıkar: 1239,84 ÷ 494 ≈ 2,51 eV, 1239,84 ÷ 512 ≈ 2,42 eV, fark yalnız 0,09 eV. Kayıp payı 0,088 ÷ 2,51 ≈ 0,035'tir, NADH'takinin yaklaşık yedide biri. Tezgâhtaki şişede parlayan yeşil, mavi-yeşil bir fotonun biraz aşağı kaymış hâlidir.

Nanosaniye ile saniye arasında

Tavandaki yıldızlar başka bir olaya örnektir. Floresans hızlıdır: floresans maddesi morötesinden yakın kızılötesine kadar uyarılmış hâlin tipik sönme süresini 0,5 ile 20 nanosaniye arasında verir, Thermo Fisher'ın el kitabı tipik değeri 1 ile 10 nanosaniye diye yazar. Fosforesansta ise uyarılmış elektron sistemler arası geçiş (intersystem crossing) denen bir adımla spini ters dönmüş bir hâle, üçlü (triplet) hâle geçer. Wikipedia'nın fosforesans maddesi bu hâlden temel hâle dönüşün kuantum kurallarınca "yasak" olduğunu, gerçekleştiğini ama çok yavaş gerçekleştiğini anlatır.

Süreler kaynaktan kaynağa değişir, ama mertebe tutar. Fosforesans maddesi üçlü hâlden ışımayı birkaç mikrosaniyeden bir saniyeye kadar, kalıcı parıltıyı birkaç saniyeden saatlere kadar verir; Harvey fosforesans ömrünü 10⁻⁴ ile 10⁴ saniye arasında yazar. İki kaynağın örtüştüğü bölge milisaniyelerden saniyelere uzanır. Floreseinin ömrü ansiklopediye göre protonlu ve protonsuz biçimlerde yaklaşık 3 ve 4 nanosaniyedir; Thermo Fisher boyanın türevi için 3,8 nanosaniye verir.

Oranı kuralım. Dört nanosaniyelik bir floresansı bir milisaniyelik bir fosforesansla karşılaştırınca 10⁻³ ÷ (4 × 10⁻⁹) = 250.000 çıkar; fosforesans bir saniye sürüyorsa oran 1 ÷ (4 × 10⁻⁹) = 2,5 × 10⁸'e çıkar. Tonik düğmeyle birlikte bu yüzden karardı. Serbest NADH'ın ömrü daha da kısadır: NAD maddesi 0,4 nanosaniye verir, Blacker ve arkadaşları 0,3–0,8 nanosaniye yazar.

Kaç foton geri döner

Uyarılmış her molekül ışımaz; bir kısmı enerjisinin tamamını ısıya verir. Floresans maddesi ve Thermo Fisher'ın el kitabı kuantum verimini aynı biçimde tanımlar: salınan foton sayısının soğurulan foton sayısına oranı. Harvey ise aynı büyüklüğü, uyarılmış moleküllerden floresansla temel hâle dönenlerin kesri diye yazar ve değerin 0 ile 1 arasında kaldığını belirtir.

Hesap girdisi olarak bir çözelti ölçüm süresince 10.000 foton soğursun, dedektör de salınan 2.000 fotonun hepsini saysın; sayılar kurgudur ve NADH'ın gerçek verimi değildir. Φ = 2.000 ÷ 10.000 = 0,20 olur. Enerji hesabı bunun da altına iner. Aynı sayımları NADH'ın dalga boylarıyla birleştirirsek salınan her foton yutulanın 2,70 ÷ 3,65 ≈ 0,74'ü kadar enerji taşır. Soğurulan ışık enerjisinin yalnız 0,20 × 0,74 ≈ 0,15'i ışık olarak geri döner, kalan 0,85 ısıya gider.

Rengi ayırmak: floresans mikroskobu

Stokes kaymasının pratik değeri bir mikroskobun içinde görülür. Wikipedia'nın floresans mikroskobu maddesi düzeneği şöyle anlatır: uyarım ışığı bir uyarım süzgecinden geçip örneğe gönderilir, çok daha zayıf olan salım ışığı ise bir salım süzgeciyle ondan ayrılır. Arada duran dikroik ayna dalga boyuna göre seçici bir süzgeç gibi çalışır, salım ışığını göze ya da dedektöre geçirir, kalan uyarım ışığını kaynağa doğru geri yansıtır. Süzgeçler ve ayna, örnekteki boyanın uyarım ve salım tayfına göre seçilir.

Kayma büyükse iki rengi ayırmak kolaydır; floreseinin yirmi nanometreye yakın kaymasında süzgeçlerin kenarları dik ve iyi konumlanmış olmalıdır. Selda Hanım'ın elindeki sarı plastik bir süzgeç bunu kaba biçimde gösterir: lambanın morunu keser, boyanın yeşilini geçirir.

Mikroskop maddesi, örneği boyamak yerine kendi doğal parıltısının, yani otofloresansın (autofluorescence) da kullanılabildiğini yazar. NADH bu parıltının kaynaklarından biridir. Blacker ve arkadaşları NADPH'ın nikotinamid halkasının floresans özelliklerinin NADH'ınkiyle aynı olduğunu belirtir; bu yüzden mavi parıltı tek başına hangi molekülden geldiğini söylemez, ikisini ayırmak ayrı bir ölçüm tekniği ister.

Perdeler aralanınca

Selda Hanım perdeleri açıyor, yıldızların parıltısı gün ışığında kayboluyor. Tunç tahtayı dikey bir çizgiyle ikiye bölüyor: birinin başına NADH, öbürüne floresein yazıyor, altlarına 0,95 ve 0,09 eV. Aralarına bir ok çekip üstüne 250.000 yazıyor. Sonra tahtanın köşesine bir soru ekliyor: "Işık dokuda bu kadar çabuk soğurulup saçılıyorsa, karnın içini gösteren cihaz neyle bakıyor?"

Kendini sına

1. Bir boya 550 nanometrede soğuruyor, 600 nanometrede ışıyor. İki fotonun enerjisini elektronvolt olarak bul; kaybolan enerji yutulanın hangi kesridir?
2. Bir örnek 50.000 foton soğuruyor ve 4.500 foton salıyor (hesap girdisi). Kuantum verimi kaçtır? Lamba kapandıktan sonra parıltı iki saniye sürdüyse bu floresans mıdır, fosforesans mı?
3. Bir floresans mikroskobunda salım süzgeci çıkarılsa görüntüde ne değişir? Stokes kayması küçük bir boyada süzgeç seçimi neden zorlaşır?

Bir sonraki derse köprü

Bu modülde şimdiye kadar hep ışıkla çalıştık: boşlukta da ilerleyen, dokuda hızla soğurulup saçılan bir alan salınımıyla. Ultrason Dalgaları dersi bir mekanik dalgaya geçecek, doku moleküllerini sıkıştırıp gevşeterek ilerleyen bir sese. Ses iki dokunun sınırına geldiğinde ne kadarı geri yansır, ne kadarı yoluna devam eder, ve bu payı belirleyen akustik empedans (acoustic impedance) dokunun hangi iki özelliğinden kurulur?