Antioksidan Savunma

Açılış sahnesi

Giresun'daki hastanenin transfüzyon merkezinde soğuk odanın kapısı her açıldığında kısa bir buğu yükseliyor. Stajının bitmesine iki hafta kalan Poyraz, raflardaki eritrosit süspansiyonu torbalarını haftalık sayım listesine tek tek işliyor; son rafı da sayınca kalemi kulağının arkasına sıkıştırıyor.

"Geçen hafta katalaz testinde, lama kan bulaşırsa negatif plağın da köpüreceğini okumuştuk," diyor. "Bu torbaların her birinde milyarlarca hücre oksijen taşıyor ve her hücre demirle dolu. Fenton tepkimesinin iki malzemesi aynı zarın içinde duruyor. Üstelik bu hücrelerin ne çekirdeği var ne mitokondrisi; bozulan bir proteinin yerine yenisini yapamıyorlar. Neyle ayakta kalıyorlar?" Şeniz Hanım sayım listesini ters çeviriyor. Arka yüzü boş. Sol üst köşeye O₂•⁻ yazıp kalemi Poyraz'a uzatıyor: "Bu türün nereye gittiğini sen yaz, sonra peroksidin."

Bu derste ne olacak

Hücrenin süperoksit ve peroksitle baş etmesini enzim enzim izleyeceğiz: süperoksit dismutaz, katalaz, glutatyon peroksidaz ve peroksiredoksin. Ardından glutatyonun kükürdünü, zarın içinde çalışan E vitaminini ve onu yenileyen C vitaminini göreceğiz. Sonunda bu tepkimelerin tek bir elektron kaynağına bağlandığını ve "antioksidan" sözcüğünün neden koşula bağlı olduğunu tartışacağız.

Metin

Aynı türün iki yöne gitmesi

1969'da Joe McCord ile Irwin Fridovich, Journal of Biological Chemistry'de sığır alyuvarından saflaştırılan ve işlevi o güne kadar bilinmeyen bir bakır proteininin süperoksidi ortadan kaldırdığını gösterdi. Protein bugün süperoksit dismutaz (superoxide dismutase, SOD) adıyla anılır ve yaptığı iş tek satırdır: 2O₂•⁻ + 2H⁺ → H₂O₂ + O₂. Adındaki "dismutasyon" sözcüğünü, redoksun ilk dersinde öğrendiğimiz yükseltgenme basamağı hesabı açar.

Süperoksitte oksijenin basamağı ortalama −½'dir. Bir süperoksit elektronunu verip O₂'ye döner ve basamağı 0'a çıkar; öbürü o elektronu alıp peroksite dönüşür ve basamağı −1'e iner. Sağlamasını dört oksijen atomu üzerinden yapabiliriz: tepkimeden önce 4 × (−½) = −2, sonra O₂'deki iki atom için 0 ve peroksitteki iki atom için 2 × (−1) = −2. Toplam korunur, dağılım ikiye ayrılır.

Enzim bu işi bakırı iki kez değiştirerek yapar. İlk süperoksit Cu²⁺'yı Cu⁺'ya indirger ve oksijen olarak ayrılır; ikinci süperoksit Cu⁺'yı geri yükseltger ve iki protonla peroksit olur. Bunun için metalin potansiyeli iki yarı tepkimenin arasında durmalıdır. Reaktif Oksijen Türleri dersinde süperoksitin peroksite indirgenmesi için 0,91 V bulmuş, oksijen suda çözünmüş kabul edilince ilk basamağın 0,17 volt kadar yukarı kaydığını not etmiştik; −0,35 + 0,17 = −0,18 V, Koppenol ve arkadaşlarının çözünmüş oksijen için verdiği değerdir. Pencerenin ortası (−0,18 + 0,91) ÷ 2 ≈ 0,37 V eder; Sheng ile arkadaşlarının 2014'teki kapsamlı derlemesi ve yapay SOD tasarlayan çalışmalar, bakır-çinko enzimindeki bakırın potansiyelini 0,3 ile 0,4 V arasına koyar. Elektron Orbitalleri dersinde (L02-P06-M01-D04) söylenen iş bölümü burada somutlaşır: Cu⁺ ile Cu²⁺ arasında gidip gelen bakır elektronu taşır, tek bir yük hâlinde kalan çinko yapıyı sabit tutar.

İnsanda üç biçim vardır. Bakır-çinko enzimi hücre sıvısında, ayrıca mitokondrinin iki zarı arasında ve çekirdekte bulunur. Mangan taşıyan biçim insanda yalnız mitokondri matriksinde çalışır; zincirden sızan süperoksidin önemli bir kısmı bu bölmeye salınır. Üçüncüsü yine bakır-çinko taşır ama hücre dışına salınır. Demirli biçim bakterilerde ve bitki kloroplastlarında görülür.

Kendiliğinden olan ile zamanında olan

Süperoksit enzimsiz de dismutasyona uğrar; pH 7'de bu tepkimenin hız sabiti 10⁵ M⁻¹s⁻¹ mertebesindedir. Ama iki süperoksit anyonu birbirini iter ve tepkime ancak biri proton alıp yüksüz hidroperoksil radikaline dönünce yürür. Asıl fark tepkimenin derecesindedir. Kendiliğinden dismutasyon ikinci derecedir; yarı ömrü süperoksit derişimine bağlıdır ve derişim düştükçe uzar. Reaksiyon Hızı dersindeki bağıntıyla, litrede bir mikromol süperoksit için yarı ömür 1 ÷ (10⁵ × 10⁻⁶) = 10 saniye çıkar. Derişim bin kat düşüp nanomola indiğinde yarı ömür 1 ÷ (10⁵ × 10⁻⁹) = 10.000 saniye, yani yaklaşık 2,8 saattir.

Enzim bu denklemi değiştirir. Bakır-çinko enziminin hız sabiti 10⁹ mertebesindedir ve sulu çözeltide iki molekülün karşılaşma sınırına yakındır. Varsayımsal olarak litrede bir mikromol enzim bulunsun: etkin sabit 10⁹ × 10⁻⁶ = 10³ s⁻¹, ln 2 ÷ 10³ ≈ 0,0007 saniyelik bir yarılanma çıkar. Bu yarı ömür artık süperoksidin kendi derişimine bağlı değildir. Sheng ve arkadaşları bunu, enzimin tepkimeyi süperoksit derişimine göre birinci dereceden iki adıma çevirmesi diye anlatır; süperoksit azaldıkça enzimin işi yavaşlamaz.

Peroksidin iki yolu

SOD'un ürünü hidrojen peroksittir; savunma burada ikiye ayrılır. Katalaz 2H₂O₂ → 2H₂O + O₂ tepkimesini yürütür. Basamaklara bakınca bu da bir dismutasyondur: peroksitteki −1'lik oksijenlerin bir kısmı 0'a çıkıp oksijen gazı olur, bir kısmı −2'ye inip suya gider. Enzim bunu hem grubundaki demirle, iki peroksidi sırayla işleyerek yapar; ökaryot hücrede çoğunlukla peroksizomdadır.

Devir sayısını, enzim kinetiğini işlediğimiz derste (L02-P06-M05-D08) bütün aktif bölgeler doluyken bir enzimin saniyede çevirdiği substrat sayısı olarak tanımlamış ve karbonik anhidraz için 10⁶ s⁻¹ dolayında bir değer görmüştük. Katalaz için bildirilen değerler saniyede 4 × 10⁷'ye kadar çıkar. Bir peroksit molekülüne düşen süre 1 ÷ (4 × 10⁷) = 2,5 × 10⁻⁸ saniye, yani 25 nanosaniyedir; karbonik anhidrazla oran 4 × 10⁷ ÷ 10⁶ = 40'tır.

İkinci yol glutatyon peroksidazdır: H₂O₂ + 2GSH → GSSG + 2H₂O. Flohé ve arkadaşları 1973'te bu enzimin bir selenoenzim olduğunu bildirdi. Aktif bölgesinde, sisteinin kükürdünün yerinde selenyum taşıyan selenosistein bulunur. Selenyum peroksitle yükseltgenir; iki glutatyon onu sırayla geri indirger ve disülfit hâlinde birleşir.

Üçüncü bir aile, peroksiredoksinler, selenyum yerine sıradan bir sistein kullanır ama o sistein özel olarak hazırlanmıştır. Peroksit bu kükürdü sülfenik aside yükseltger; sülfenik asit ikinci bir sisteinle disülfit köprüsü kurar. Bağ türlerini işlerken (L02-P06-M02-D02) protein zincirinin uzak parçalarını birleştiren yapı olarak tanıdığımız bu köprüyü, tiyoredoksin adlı küçük bir protein açar. Reaktif Oksijen Türleri dersinde serbest sisteinin peroksitle hız sabitinin 10 dolayında olduğunu görmüştük. Peroksiredoksinlerin peroksidik sisteini için yayımlanmış değerler 10⁶ ile 10⁸ arasındadır; 10⁷ ÷ 10 = 10⁶ kat fark, aynı kükürdün protein içinde nasıl başka bir kimyaya kavuştuğunu gösterir.

Glutatyonun kükürdü ve Nernst

Glutatyon hücre içinde milimolar düzeyde bulunur ve büyük kısmı indirgenmiş formdadır. GSSG'yi geri çeviren enzim glutatyon redüktazdır: GSSG + NADPH + H⁺ → 2GSH + NADP⁺. NADP⁺/NADPH çiftinin biyokimyasal standart potansiyeli −0,32 V dolayındadır. Glutatyon çifti için tablolar −0,23 ile −0,24 V arasında değer verir. −0,24'ü alırsak ΔE°' = −0,24 − (−0,32) = 0,08 V, serbest enerji −2 × 96,485 × 0,08 ≈ −15,4 kJ/mol olur. Elektron NADPH'dan glutatyona yokuş aşağı akar.

Elektron Taşıyıcılar dersinde hücre sıvısındaki NAD⁺ havuzunun büyük ölçüde yükseltgenmiş tutulduğunu görmüştük. NADP⁺ havuzu tersine, büyük ölçüde indirgenmiş tutulur; standart potansiyelleri hemen hemen aynı olan iki çift hücrede farklı işler görür. O derste reaktif kasetinde okunan glukoz-6-fosfat dehidrojenaz, hücrede NADP⁺'yı NADPH'ya çeviren başlıca enzimlerden biridir. Mitokondrisi olmayan alyuvar, glutatyonunu yenilemek için bu yola dayanır.

Glutatyon çiftinin Nernst denklemi, Redoks Potansiyeli dersinde NAD⁺ için yazdığımızdan bir noktada ayrılır. İki GSH tek bir GSSG verdiği için oranda GSH'ın karesi yer alır: E = −0,240 − (0,05916 ÷ 2) × log([GSH]² ÷ [GSSG]). Litrede 5 milimol GSH ve 0,05 milimol GSSG bulunsun; oran 100'e 1'dir. 0,005² ÷ 0,00005 = 0,5, logaritması −0,301'dir ve E ≈ −0,231 V bulunur. Şimdi ikisini de on kat seyreltelim: 0,0005² ÷ 0,000005 = 0,05, logaritma −1,301, E ≈ −0,202 V. Oran hâlâ 100'e 1 olduğu hâlde potansiyel yaklaşık 30 milivolt yükseldi. NAD⁺ çiftinde yalnız oran önemliydi; glutatyonda toplam miktar da potansiyeli belirler.

Bu hesabın bir sınırı var. Berndt, Lillig ve Flohé 2014'teki bir derlemede, küçük tiyollerin peroksitle kendiliğinden tepkimesinin çok yavaş olduğunu ve glutatyona bağlı tepkimelerin denge değil enzim hızlarıyla yönetildiğini vurguladı. Nernst potansiyeli havuzun durumunu tarif eder, ama elektronları hangi hedefe hangi hızla gönderdiğini enzimler belirler.

Zarın içindeki zincir

Serbest Radikaller dersinde bir radikalin ilerleme adımında yok olmadığını, zincir tepkimesinde bir sonraki moleküle devredildiğini görmüştük. Zar lipitlerinde bu zincir, çoklu doymamış yağ asitlerinin çift bağlar arasındaki hidrojenleri üzerinden yürür: lipit peroksil radikali komşu yağ asidinden bir hidrojen koparır, bir lipit hidroperoksidi ve yeni bir lipit radikali doğar.

Yağda çözünen tokoferol, yani E vitamini, zarın içinde peroksil radikaline kendi hidrojenini verir. Oluşan tokoferoksil radikali, eşleşmemiş elektronunu halkası boyunca dağıttığı için komşu lipide saldıramaz; zincir burada kırılır. Tokoferolün bir kez kullanılıp tükenmesi gerekmez. Packer, Slater ve Willson 1979'da Nature'da, tokoferoksil radikalinin askorbatla, yani C vitaminiyle geri indirgendiğini doğrudan gözlemlediklerini bildirdi. Askorbat zarın su tarafında durur; yükseltgenmiş biçimi dehidroaskorbat da glutatyon ve başka tiyollerle askorbata döner.

Bu halkaları uç uca eklediğimizde bir yol çıkar: lipit radikali → tokoferol → askorbat → glutatyon → NADPH → glukoz. Her halkada bir tür yükseltgenir ve bir sonraki halka onu geri indirger. Yükseltgeyici yük yok edilmez; zardan su fazına, oradan hücre sıvısındaki havuza aktarılır ve sonunda şekerin yakılmasından gelen elektronlarla karşılanır.

"Antioksidan" koşula bağlı bir sıfat

Askorbat bunun en bilinen örneğidir. Güçlü bir indirgen olduğu için tokoferoksil radikaline elektron verir; aynı nedenle Fe³⁺'ya da elektron verir ve onu Fe²⁺'ya çevirir. Reaktif Oksijen Türleri dersinde Fe²⁺'nın peroksitle karşılaşınca hidroksil radikali ürettiğini görmüştük. Serbest demir bulunan bir ortamda askorbat, Fenton döngüsünü süperoksitten daha hızlı çevirebilir. Buettner ile Jurkiewicz 1996'daki bir derlemede askorbatın hem pro-oksidan hem antioksidan olabileceğini, iki davranış arasındaki geçiş noktasının ortamdaki katalitik metal miktarına bağlı olduğunu yazdı.

Bu yüzden bir maddenin kimyasından tek başına "koruyucu" sonucu çıkmaz. Takviye olarak alınan bir antioksidanın bu ağdan ne sonuç çıkardığı ise ayrı bir soru olarak kalacak.

Sayım listesinin arka yüzü

Poyraz O₂•⁻'den bir ok çekip ucuna "SOD, Cu⁺ ⇄ Cu²⁺" yazıyor, okun iki çatalına O₂ ve H₂O₂ koyuyor. Peroksitten iki ok daha çıkıyor: biri "katalaz, 25 ns", öbürü "GPx, Se" etiketli, ikisi de H₂O'da buluşuyor. GPx okunun yanına küçük bir GSSG yazınca Şeniz Hanım sayfanın alt kenarına NADPH ekleyip ondan yukarı doğru, GSSG'ye uzanan uzun bir ok çiziyor. Poyraz okun dibine "glukoz-6-fosfat" yazıyor. Kâğıt, arka yüzü dışarıda, sayım klasörüne takılıyor.

Kendini sına

1. Süperoksitin dismutasyonunda hangi oksijen atomları yükseltgenir, hangileri indirgenir? Katalazın tepkimesi neden de bir dismutasyondur?
2. Bir metal iyonunun süperoksit dismutaz gibi çalışabilmesi için potansiyelinin −0,18 V ile 0,91 V arasında durması neden gerekir?
3. Kendiliğinden dismutasyonun hız sabiti 10⁵ ise litrede 10 nanomol süperoksidin yarı ömrü ne olur? Litrede bir mikromol enzim varken bu yarı ömür neden süperoksit derişimine bağlı değildir?
4. Litrede 5 milimol GSH ve 0,05 milimol GSSG içeren bir bölmede GSH'ın onda biri yükseltgenirse potansiyel ne olur?

Bir sonraki derse köprü

Bu derste savunmayı enzimlerden, glutatyondan ve iki vitaminden oluşan bir ağ olarak izledik ve yükün bu ağda aktarıldığını gördük. Antioksidan Takviyesi Mantığı dersinde soru dışarıdan bakacak: ağa eklenen bir takviye hangi halkaya girer ve bu kimyanın tutarlılığı, takviyenin sağlık sonucunu öngörmeye yeter mi? Mekanizmadan sonuca yapılan çıkarımın randomize çalışmalarla sınandığında ne kadar tuttuğu orada tartılacak.