Enzimlerin Katalitik Rolü

Açılış sahnesi

Dönemin son uygulama günü, saat on biri çeyrek geçiyor. Bolu'da, gıda analizi yapılan laboratuvarın tezgâhındaki altı tüpün her birinde başka derişimde bir sakaroz çözeltisi var ve hepsine aynı hacimde, mayadan elde edilmiş bir enzim çözeltisi ekleniyor. On dakika sonra tepkime durduruluyor, açığa çıkan glukoz renkli bir ayıraçla ölçülüyor ve Yağız'ın geçen hafta prova yaptığı spektrofotometre sırayla okuyor. Nehir iki uçtaki tüpün sonucunu Yağız'a gösteriyor.

"Şekeri dokuz katına çıkardım, glukoz iki katına bile çıkmadı. Geçen hafta sizin boyanız derişimle orantılı soluyordu; bu tepkime neden aynı kurala uymuyor?" Ülkü Hanım cevap vermek yerine eksenleri çiziyor, eğriyi önce dik başlatıp sonra yatıştırıyor ve üstüne kesikli, yatay bir çizgi çekiyor. Çizginin adını koymuyor; o adı Nehir'in altı tüpü koyacak.

Bu derste ne olacak

Enzimi bir katalizör olarak tanımlayıp substratın bağlandığı yeri ve iki klasik bağlanma modelini ele alacağız. Nehir'in tüplerinden Michaelis–Menten bağıntısını kuracak, ardından tek bir enzimin işini, sıcaklığı, pH'ı, iki inhibisyon türünü ve kofaktörleri göreceğiz.

Mekanizma

Protein bir katalizör

Aktivasyon Enerjisi dersinde katalizörü tepkimeye alçak bir tepeden geçen başka bir yol sunan madde olarak tanımlamış, ileri ve geri engelin aynı miktarda alçaldığını, bu yüzden denge sabitinin yerinde kaldığını görmüştük. Enzim bu tanımın canlıdaki karşılığıdır. Nehir'in tüplerindeki enzim sakarozu glukoz ile fruktoza ayırır; Arrhenius'un 1889'da sıcaklıkla hızını ölçtüğü tepkime de buydu, yalnız katalizör asitti.

Karbonik anhidrazın etkin bölgesindeki çinkoyu asit ve baz tanımları konuşulurken görmüştük. Emil Fischer 1894'te enzimin yalnız belirli biçimdeki şekere etki ettiğini gösterdi ve bunu anahtar ile kilide benzetti. Daniel Koshland 1958'de PNAS'ta bu resmi değiştirdi: aktif bölge katı bir kalıp değildir, substrat bağlandıkça yan zincirler yeniden dizilir ve cep substratın çevresinde kapanır. Uyarılmış uyum adı verilen bu modelde bağlanmak yetmez, yan zincirlerin doğru yere oturması gerekir.

Engelin nasıl alçaldığının nitel cevabı şudur: cep, substratın kendisinden çok geçiş hâline uyar. Yan zincirler geçiş hâlinin yüklerine zıt yükler, hidrojen bağları ve doğru açıyı sunar; o düzenleme cebin içinde çözeltidekinden daha düşük bir enerjide durur. Substratı cebe fazla sıkı bağlayan bir enzim ise onu bir çukura hapseder ve tepkimeyi yavaşlatır.

Altı tüp, bir eğri

Sakaroz derişimleri litrede 5, 10, 20, 40, 80 ve 180 milimol olan tüpler dakikada 0,12, 0,20, 0,30, 0,40, 0,48 ve 0,54 milimol/L glukoz verir. Altı sonuç tek bir bağıntıya oturur.

Nehir'in enzimi için Vmax = 0,60 ve Km = 20 milimol/L alınmıştır. Km'deki tüpte hız 0,60 × 20 ÷ (20 + 20) = 0,30 olur, yani Vmax'ın tam yarısı. [S] = Km yazıldığında paydada 2Km kalır ve kesir 1 ÷ 2'ye iner. Son tüp Km'nin dokuz katındadır: 0,60 × 180 ÷ 200 = 0,54 ve 0,54 ÷ 0,60 = 0,90. [S] = 9Km her enzimde 9 ÷ 10 oranını verir; yüzde doksan doyma için substratın Km'nin dokuz katına çıkması gerekir. Tahtadaki kesikli çizgi Vmax'tır ve eğri ona yaklaşır ama sonlu bir derişimde değmez.

Nehir'in sorusunun cevabı Reaksiyon Hızı dersindeki derecelerde duruyor. Düşük derişimde paydada Km baskındır ve bağıntı v ≈ (Vmax ÷ Km)[S] biçimine iner: 0,60 ÷ 20 = 0,030 dk⁻¹ katsayılı, birinci dereceye yakın bir yasa. 5 milimol/L'de bu yaklaşım 0,15 verir, gerçek değer 0,12'dir. Yüksek derişimde paydada [S] baskındır ve hız Vmax'a, yani sıfırıncı dereceye yaklaşır. Derişimi 5'ten 10'a çıkarmak hızı 0,20 ÷ 0,12 ≈ 1,67 katına taşırken 80'den 160'a çıkarmak yalnız 0,533 ÷ 0,48 ≈ 1,11 katına taşır. İlaç konsantrasyonunun zamanla değişimini konuştuğumuz derste doygun bir uzaklaştırma yolunun sıfırıncı dereceye yaklaştığını görmüştük; aynı biçim burada enzimin dolu ceplerinden gelir.

Leonor Michaelis ile Maud Menten bu bağıntıyı 1913'te Biochemische Zeitschrift'in 49. cildinde, 333–369. sayfalarda, invertaz adlı bu sakaroz enziminin kinetiği üzerine yayımladılar. Ölçümü, sakaroz ayrıştıkça çözeltinin polarize ışığı çevirme yönünün değişmesinden yaptılar ve bağlanmanın hızla dengeye geldiğini varsaydı; Briggs ile Haldane 1925'te aynı denklemi, enzim–substrat kompleksinin derişiminin kısa sürede sabitlendiği varsayımıyla yeniden türetti. Km bu yüzden her enzimde bağlanma sabitiyle aynı şey değildir.

Tek bir enzimin işi

Vmax tüpteki enzim miktarına bağlıdır; iki kat enzim iki kat tavan verir. Nehir'in tüplerinde enzimin derişimi litrede 0,00010 milimol olsaydı, kcat = 0,60 ÷ 0,00010 = 6000 dk⁻¹, yani saniyede 100 devir olurdu. Karbonik anhidrazın en hızlı biçimi olan karbonik anhidraz II ise saniyede yaklaşık bir milyon devire ulaşır. Bir devir yaklaşık 1 ÷ 10⁶ saniye, yani bir mikrosaniye sürer. Bu enzimde hızı sınırlayan adım, çinkoya bağlı sudan kopan protonun aktif bölgenin kenarındaki bir histidine, oradan da çevredeki suya aktarılmasıdır. kcat ÷ Km oranı ise substratın cebe difüzyonla ulaşma hızının koyduğu sınıra yaklaşır.

Sıcaklık ve pH

Aktivasyon Enerjisi dersindeki örnek engelde oda sıcaklığından vücut sıcaklığına geçmek hız sabitini iki katından biraz fazla büyütmüştü; enzimli yol da ısındıkça hızlanır, ama bu yolu bir protein taşır. Zayıf etkileşimleri protein yapısı üzerinden konuştuğumuz derste (L02-P06-M02-D07) katlanmış biçimi tutan payın birkaç hidrojen bağı kadar küçük olduğunu ve denatürasyonun zinciri koparmadan biçimi bozduğunu görmüştük. Bir noktadan sonra ısı aktif bölgeyi dağıtır ve eğri bir tepe çizer.

pH ise aktif bölgedeki grupların yükünü belirler. Kanın proteinlerini tampon olarak incelediğimiz derste (L02-P06-M04-D07) histidinin imidazol halkasının pKa'sının fizyolojik pH'a yakın düştüğünü, ortam değişince protonlu payın kaydığını hesaplamıştık. Bir enzim, işi için bir grubun protonlu, öbürünün protonsuz olmasını gerektiriyorsa ancak ikisinin de doğru hâlde bulunduğu bir pH aralığında hızlı çalışır.

İnhibisyon: aynı cep, başka cep

Enzime bağlanıp işini yavaşlatan moleküllerin iki temel türü eğride farklı izler bırakır; ayrıntıları ileride Enzimler modülünde açılacak.

Kompetitif bir inhibitör, kendi ayrışma sabitine eşit derişimde bulunduğunda görünür Km'yi 20 × (1 + 1) = 40 milimol/L'ye çıkarır. Km'deki tüp artık 0,60 × 20 ÷ 60 = 0,20 verir, yani 0,30'dan düşer. Oysa 180'deki tüp 0,60 × 180 ÷ 220 ≈ 0,49 verir ve inhibitörsüz değerin onda dokuzunu korur. Aynı derişimde kompetitif olmayan bir inhibitör tavanı 0,60 ÷ 2 = 0,30'a indirir; 180'deki tüp 0,27'de kalır ve hiçbir derişim onu 0,30'un üstüne çıkaramaz. İki tür, düşük derişimde benzer bir kayıp gösterir; ayrım, yüksek derişimde tavanın geri gelip gelmediğinden okunur.

Kofaktör ve koenzim

Bazı enzimler yalnız amino asitlerle çalışmaz. Karbonik anhidrazın çinkosu, histidin halkalarına bağlı bir metal iyonu olarak suyu tepkimeye hazırlar ve tepkime boyunca yükünü değiştirmez.

Modelin sınırı

Michaelis–Menten eğrisi tek bir substratı ve geri dönmeyen bir ürünü varsayar. Oysa hücredeki enzimlerin çoğu iki ya da daha çok substratla çalışır, ürün birikince tepkime geriye de işler ve ürünün kendisi enzimi yavaşlatabilir.

Bağıntı, enzimin substrattan çok daha az bulunduğu seyreltik bir çözeltiye göre kurulmuştur. Hücrenin içi kalabalıktır, enzimler bölmelere dağılmıştır ve bazı yollarda enzim ile substrat benzer derişimdedir. Tüpte ölçülen Km ile Vmax hücredeki hızı doğrudan vermez.

Her enzim hiperbolik bir eğri çizmez. Birden çok alt birimi olan bazı enzimlerde bir substratın bağlanması öbür ceplerin ilgisini değiştirir ve eğri S biçimini alır; bu düzenlemeye allosterik düzenleme denir ve Enzimler modülünde ayrıca işlenecek.

Enzimin protein olduğu genellemesi de tam değildir. Katalitik RNA molekülleri, yani ribozimler vardır ve ribozom protein ile katalitik RNA'nın birlikte çalıştığı bir yapıdır.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Enzimin nasıl çalıştığını bilmek, sindirim enzimi takviyesinin, "enzim desteği" diye sunulan bir ürünün ya da bir kofaktör takviyesinin bedendeki bir enzimin hızını değiştirdiğini göstermez. Tüpe eklenen enzim ya da metal iyonu hızı artırabilir; ağızdan alınan bir ürünün hedef hücrede aynı şeyi yapıp yapmadığını ancak sonucu ölçen karşılaştırmalı çalışmalar söyler. Kofaktör kavramı ve bir kofaktörün varlığından takviye gerektiği sonucunu çıkaran yanılgı ileride ayrı derslerde ele alınacak.

Ders, kanda ölçülen enzim düzeylerinin yorumunu, bir ilacın hangi enzimi etkilediğini ya da bir enzim eksikliğinin tanısını göstermiyor. Km, Vmax ve enzim derişimi kurgudur; hiçbir enzimin bedendeki değerini temsil etmez.

Modülü toplarken

Bu modülde bir tabletin yanışını enerjinin muhasebesiyle, yönüyle ve hızıyla okuduk. İç enerji ve entalpi el değiştiren enerjiyi, entropi ve Gibbs enerjisi gidilebilecek yönü, denge sabiti durulacak yeri söyledi; aktivasyon enerjisi ve hız yasası ise varış süresini ayrı bir soru olarak kurdu. Enzim bu iki sorunun ayrıldığı yerde durur: gidilecek yeri değiştirmez, yolun süresini değiştirir.

Altı tüpün söylediği

Nehir kesikli çizginin yanına "Vmax" yazıyor, yarı yükseklikten aşağı inip yatay eksende 20'yi işaretliyor. Yağız son tüpün yanına küçük bir not ekliyor: dokuz katı şeker, onda dokuz hız. Ülkü Hanım ölçüm kâğıtlarını dosyaya koymadan önce altına bir satır daha yazdırıyor: "Maya enzimi, 25 °C, tampon pH'ı yazılacak".

Kendini sına

1. Km'si 5 milimol/L olan bir enzimde substrat 5, 15 ve 45 milimol/L iken hız Vmax'ın kaçta kaçıdır?
2. Vmax'ın yüzde seksenine ulaşmak için substrat Km'nin kaç katı olmalıdır? Bağıntıdan türet.
3. Bir inhibitör eklendiğinde düşük substratta hız azalıyor, çok yüksek substratta ise inhibitörsüz tavana dönüyor. Hangi tür inhibisyondur ve Km ile Vmax'a ne olmuştur?
4. Bir enzimin tavanı tüpteki enzim miktarı iki katına çıkınca ne olur? Km değişir mi?
5. "Bu enzim 37 °C'de en hızlı çalışır" cümlesi hangi ölçüm koşullarını saklıyor olabilir?

Bir sonraki derse köprü

Karbonik anhidrazın çinkosu tepkime boyunca hep aynı yükte kaldı; enzim bir protonu taşıdı, elektron alıp vermedi. Oysa atomları ve iyonları konuşurken bakırın Cu⁺ ile Cu²⁺, demirin Fe²⁺ ile Fe³⁺ arasında gidip gelebildiğini görmüştük. Yeni modülün ilk dersi Oksidasyon ve İndirgenme bunu soracak: elektron aktarımında hangi madde yükseltgenir, hangisi indirgenir ve bir atomun yükseltgenme basamağı bu alışverişi nasıl kayda geçirir?