Proteinlerin Tampon Rolü

Açılış sahnesi

Salı, öğleden sonra ikiye yirmi var. Hastanenin birinci katındaki hematoloji laboratuvarında hematokrit santrifüjü yavaşlayıp duruyor. Tuna, sayım cihazı için gelen hemoliz reaktifi kolisini tezgâha bırakmış; Seher Hanım reaktiflerin son kullanma tarihlerini sevk listesiyle karşılaştırıyor. Santrifüjden çıkan ince cam kapiller tüplerden biri okuma kartının üstünde duruyor: altta koyu kırmızı bir sütun, üstünde ince beyaz bir çizgi ve en üstte saman sarısı, berrak bir sıvı.

Tuna tüpü ışığa tutuyor: "Cuma günü kapalı kaba asit eklediğimizde bikarbonat tek başına yetmemişti ve yükün ilk anını başka tamponların karşıladığını söylemiştik. O tamponlar bu tüpte mi? Alttaki kırmızı kısım hemoglobin; ama hemoglobin oksijen taşımıyor mu, asitle ne işi var?". Seher Hanım tüpün iki rengini gösteriyor: üstte plazma ve içindeki proteinler, altta hücreler ve içlerini dolduran protein.

Bu derste ne olacak

Bir proteinde protonu tutabilen grupları sayacak ve histidinin halkasının fizyolojik pH'ta neden ötekilerden ayrıldığını iki pH'ta hesaplayacağız. Hemoglobinin bir litre kandaki histidin sayısından kaba bir proton bağlama kapasitesi çıkaracak, oksijenini bırakan hemoglobinin neden daha çok proton aldığını Bohr ve Haldane etkileriyle bağlayacağız. Son olarak plazmadaki albümini ve hücre içi tamponları aynı çerçeveye yerleştireceğiz.

Mekanizma

Zincirin üstündeki asitler ve bazlar

Bir protein, amino asitlerin peptit bağlarıyla dizildiği bir zincirdir ve bu bağlar kurulurken amino asitlerin çoğu asidik ya da bazik grubunu harcar. Geriye iki tür grup kalır. Birincisi zincirin iki ucudur: bir uçta serbest bir amino grubu, öbür uçta serbest bir karboksil grubu durur. İkincisi yan zincirlerdir: aspartat ve glutamatın karboksilleri, lizinin amino grubu, argininin guanidin grubu, sisteinin tiyolü, tirozinin fenolü ve histidinin imidazol halkası. Her biri Brønsted anlamında bir asit–baz çiftidir ve her birinin kendi pKa'sı vardır.

Bu grupların çoğu kan pH'ında işe yaramaz, çünkü eşikleri 7,40'tan birkaç birim uzaktır: karboksiller bu pH'ta neredeyse tamamen protonsuz, lizin ve arginin neredeyse tamamen protonlu durur. Tampon işini, pKa'sı pH'a en yakın olan grup görür. pKa dersinde serbest histidinin yan zincir pKa'sını 6,0 dolayında bulmuş, aynı grubun katlanmış proteinlerde ortalama 6,6 ve standart sapması 1,0 olan bir dağılım gösterdiğini Grimsley, Scholtz ve Pace'in derlemesinden okumuştuk.

Protonlu formun payı, Henderson–Hasselbalch dersinde kurduğumuz kesirle hesaplanır: pay = 1 ÷ (1 + 10^(pH − pKa)). Serbest histidinde pH 7,40 için üs 1,4 olur ve 1 ÷ 26,1 ≈ 0,038 bulunur; halkaların yalnız yüzde dördü protonludur. Protein içindeki ortalama pKa olan 6,6 ile aynı hesap 1 ÷ 7,31 ≈ 0,137 verir. pH 7,20'ye indiğinde pay 1 ÷ 4,98 ≈ 0,201'e çıkar. Böylece 0,2 birimlik bir asitlenme, pKa'sı 6,6 olan her histidine 0,201 − 0,137 = 0,064 proton bağlatır.

Protein ortamı bu yüzden hesabın içindedir. Protein Yapısında Zayıf Etkileşimler dersinde (L02-P06-M02-D07) tuz köprülerini ve hidrofobik çekirdeği tanımlamıştık; bir histidinin yanında eksi yüklü bir karboksil durması artı yüklü formu kolaylaştırır, suya kapalı, gömülü bir bölge ise zorlaştırır. Aynı dizideki iki histidin bu yüzden farklı pH'larda proton alır.

Kırmızı sütundaki protein

Hemoglobin iki alfa ve iki beta zincirinden oluşan bir tetramerdir. UniProt'taki insan dizilerinde başlangıç metiyonini düşüldükten sonra alfa zinciri 141, beta zinciri 146 amino asit taşır; alfa zincirinde 10, beta zincirinde 9 histidin sayılır. Tetramerde bu 2 × 10 + 2 × 9 = 38 histidin eder ve Brandis'in fizyoloji kitabı ile Deranged Physiology'nin tampon bölümü aynı sayıyı yazar. Dizilerden ve dört hem grubundan hesaplanan molar kütle yaklaşık 64.450'dir; Wikipedia'nın hemoglobin maddesi 64.458 verir.

Brandis ile LITFL'nin tampon notu, bir litre kanda 150 gram hemoglobin ve 70 gram plazma proteini bulunan bir örnek üzerinden konuşur. Bu örnekte hemoglobinin molar derişimi 150 ÷ 64.500 ≈ 0,00233 mol/L, yani yaklaşık 2,33 milimol tetramerdir. Histidin olarak 2,33 × 38 ≈ 88 milimol eder.

Bu sayıdan kaba bir kapasite çıkar. Bütün histidinlerin pKa'sı 6,6 olsaydı, pH 7,40'tan 7,20'ye inerken bir litre kanın hemoglobini 88 × 0,064 ≈ 5,6 milimol proton bağlardı. Bu bir tahmin değil bir ölçek hesabıdır: histidinlerin pKa'ları tek bir sayı değildir ve kırmızı hücrenin içi plazmayla aynı pH'ta durmaz. Yine de büyüklük sırası öğreticidir. Bikarbonat dersindeki kapalı kaba eklediğimiz 10 milimollük yükün yarısından fazlası, pH'ı yalnız 0,2 birim oynatarak proteinin halkalarına yerleşebilirdi.

Oksijen giderken proton gelir

Hemoglobin oksijenini bıraktığında biçim değiştirir ve bu yeni biçimde bazı grupların çevresi değişir. Beta zincirinin son amino asidi, 146. sıradaki histidin, bu gruplardan biridir; UniProt dizisi zincirin bu kalıntıyla bittiğini gösterir. Oksijensiz biçimde yakınındaki eksi yüklü bir karboksille tuz köprüsü kurar ve bu komşuluk halkanın pKa'sını yukarı iter. Sonuç olarak deoksihemoglobin, oksihemoglobinden daha iyi bir proton alıcısıdır.

Aynı denge ters yönden de okunur. Christian Bohr, Karl Hasselbalch ve August Krogh, 1904'te Skandinavisches Archiv für Physiologie'nin 16. cildinde (402–412. sayfalar) köpek kanında karbon dioksit basıncı arttıkça kanın oksijen bağlamasının azaldığını gösterdiler. Sonraki çalışmalar etkinin büyük kısmının pH değişiminden geldiğini ortaya koydu.

Madalyonun öbür yüzü on yıl sonra yazıldı. Christiansen, Douglas ve Haldane, 1914'te Journal of Physiology'de oksijensiz kanın aynı karbon dioksit basıncında daha çok karbon dioksit taşıdığını bildirdiler. Dokuda karbon dioksit kırmızı hücreye girer, karbonik anhidraz onu karbonik aside çevirir ve oluşan proton oksijenini yeni bırakmış hemoglobine bağlanır. Proton ortadan çekildiği için denge bikarbonat yönünde ilerler ve bikarbonat hücreden plazmaya geçer. Akciğerde hemoglobin oksijen alınca protonları bırakır ve süreç tersine döner.

Kan karbon dioksiti üç yolla taşır: plazmada çözünmüş gaz olarak, proteinlerin serbest amino gruplarına doğrudan bağlanmış karbamino bileşikleri olarak ve bikarbonat olarak. En büyük pay bikarbonattadır. Öteki iki yolun payları, kaynağın kanın toplam karbon dioksit içeriğine mi yoksa dokudan akciğere taşınan farka mı baktığına göre değişir; bu yüzden burada tek bir yüzde vermiyoruz.

Plazmanın proteini ve hücrenin içi

Plazmada en bol protein albümindir. UniProt'taki P02768 kaydında olgun zincir 585 amino asittir ve bu zincirde 16 histidin sayılır; albüminin metal bağlama bölgelerini inceleyen çalışmalar da aynı sayıyı yazar. Diziden hesaplanan molar kütle yaklaşık 66.400'dür. Aynı kütlede hemoglobinin histidini albüminin kabaca 2,4 katıdır: 38 ÷ 64.500 ve 16 ÷ 66.400 oranlarının bölümü bu değeri verir. Brandis, hemoglobinin kanda plazma proteinlerinden yaklaşık altı kat önemli olduğunu, bunun iki kat derişim ile molekül başına yaklaşık üç kat histidinden geldiğini yazar.

Albüminin ikinci bir asit-baz rolü yük taşımasıdır. Kan pH'ında albümin net eksi yüklüdür; rutin panelde ölçülmeyen eksi yüklerin önemli bir bölümünü o taşır. Anyon açığı, ölçülen artı yüklerle ölçülen eksi yükler arasındaki farktır ve albümin bu farkın içindeki başlıca sessiz anyondur. Albümin derişimi düştüğünde anyon açığı da küçülür ve başka bir anyonun birikmesini gizleyebilir. Bu ilişkinin sayısal düzeltmeleri klinik yorum konusudur ve bu dersin dışındadır.

Hücrenin içi başka bir tablodur. Orada başlıca tamponlar hücre içi proteinler ile organik ve inorganik fosfatlardır. Fosfatın 7,2 civarındaki ikinci pKa'sını tampon hazırladığımız derslerde kullanmıştık; aynı denge hücrenin içinde de tampon aralığında durur ve proteinlerin halkalarıyla birlikte çalışır.

Modelin sınırı

Tek bir "protein pKa'sı" yoktur. Grimsley ve arkadaşlarının dağılımında histidin pKa'sının standart sapması bir birimdir; bu, iki proteinin ya da aynı proteindeki iki halkanın on kat farklı hidronyum derişimlerinde yarı yarıya protonlanabileceği anlamına gelir. Kaba kapasite hesabındaki 6,6 bu dağılımın yalnız ortalamasıdır.

Gruplar birbirinden bağımsız da titre olmaz. Bir halka proton aldığında molekülün yükü değişir ve komşu grupların pKa'ları kayar; oksijenin gidişi gibi bir biçim değişimi ise titrasyon eğrisinin tamamını başka bir konuma taşır. Öğretim kaynaklarının oksihemoglobin ve deoksihemoglobine yazdığı tek "pKa" sayıları bu yüzden birbirinden belirgin biçimde ayrılır; ortak oldukları tek nokta deoksi biçimin daha yüksek olduğudur.

Hesap kanı tek bir sıvı gibi aldı. Oysa hemoglobin kırmızı hücrenin içinde, albümin plazmada durur ve iki bölmenin pH'ı, iyon bileşimi ve protonun zardan geçiş hızı aynı değildir. Hücre içi tamponlar da kendi bölmelerinin koşuluna göre çalışır.

Albüminin yükü de sabit değildir. Klorür gibi eksi ve kalsiyum gibi artı iyonları bağladıkça net yükü değişir; bu yüzden tüpte ölçülen özelliklerle kurulan denklemler vücuttaki yükü her zaman tam yansıtmaz.

Bu ders neyi göstermiyor

Mekanizmanın tutarlılığı bir müdahaleyi desteklemiyor; kararı L01-P02 tasarımlarıyla üretilmiş kanıt destekler. Proteinlerin tampon olması, protein alımını artırmanın, bir amino asit takviyesinin ya da "asit-baz dengesini destekler" diye sunulan bir ürünün kanın tampon gücünü değiştirdiğini göstermez; böyle bir etkiyi ancak kan tamponlarını sonuç olarak ölçen karşılaştırmalı çalışmalar sınayabilir.

Ders kan sayımı, kan gazı ya da biyokimya sonuçlarının nasıl yorumlanacağını göstermiyor. Hesaplardaki 150 ve 70 gram/L değerleri örnektir; kansızlık ya da düşük albümin gibi durumların tampon gücünü klinikte ne kadar değiştirdiği, anyon açığının albümine göre nasıl düzeltileceği ve bunların tanı ve tedaviye yansıması bu mekanizmadan çıkarılamaz.

Okuma kartının kenarında

Tuna kapiller tüpü kutusuna geri koymadan önce okuma kartının kenarına iki satır yazıyor: "Üstte albümin, 16 histidin. Altta hemoglobin, 38 histidin, üstelik oksijenini bırakınca daha çok proton alıyor". Seher Hanım reaktif listesini imzalarken bir satır ekletiyor: "pKa'lar tek sayı değil; ortam değişince eşik de değişir".

Kendini sına

1. Histidin pKa'sı 7,0 olan bir halkanın pH 7,40 ve 7,20'de protonlu payını hesapla. Asitlenme bu halkaya kaç proton bağlatır? 6,6 ile bulunan 0,064 ile karşılaştır.
2. Bir litre kanda 120 gram hemoglobin olan bir hesap örneğinde tetramer ve histidin derişimini hesapla. Aynı 0,2 birimlik asitlenmede kaba kapasite nasıl değişir?
3. Deoksihemoglobin neden daha iyi bir proton alıcısıdır? Bohr etkisi ile Haldane etkisini aynı dengenin iki yüzü olarak anlat.
4. Albüminin tampon payı hemoglobininkinden küçük olduğu hâlde asit-baz tablosunda neden önemlidir? Anyon açığı kavramını kullan, sayı verme.
5. "Bu proteinin pKa'sı 6,8'dir" cümlesinde hangi varsayımlar saklıdır?

Bir sonraki derse köprü

Bu modülde asitlik sabitini, pKa'yı, tampon oranını, Henderson–Hasselbalch satırını, açık sistemi ve proteinlerin halkalarını tek tek kurduk. Modülün kapanış görevi Tampon Problemleri olacak: bir tampon hazırlanacak ya da bir yükün etkisi tahmin edilecek, sen de önce hangi aracın o soruya uyduğunu seçip hesabı kendin kuracaksın. Kısayolun nerede geçerli olduğunu, kabın açık mı kapalı mı olduğunu ve pKa'nın hangi koşulda ölçüldüğünü her adımda sorman gerekecek.