Tampon Sistemleri

Açılış sahnesi

Çarşamba sabahı, saat sekizi yirmi beş geçiyor. Hastanenin ikinci katındaki mikrobiyoloji laboratuvarında besiyeri hazırlama odasının pencereleri buğulu, otoklav az önce ilk turunu bitirmiş. Tezgâhta mikrobiyolojiden gelen bir istek fişi duruyor: "pH 7,4'te fosfat tamponu, bir litre, cuma sabahına." Fosfat tuzlarının kavanozu boş çıkınca Tuna depodan iki şişe getirmiş, biri asetik asit, öteki sodyum asetat.

"Formlarda pKa'larını yazmıştık, bunlar zayıf asit ve eşlenik bazı," diyor Tuna, şişeleri yan yana koyarken. "Olmazsa hidroklorik asitle sodyum klorürü karıştırırız; o da bir asit ve onun tuzu sonuçta." Seher Hanım fişi alıp iki şişenin arasına bırakıyor. "İkisini de kâğıt üstünde deneyelim. Önce bir litre suya biraz asit damlatalım, sonra aynı damlayı senin karışımına."

Bu derste ne olacak

Tamponu bir çift olarak tanımlayacak, içine eklenen güçlü asidin nereye gittiğini mol mol izleyeceğiz. Aynı miktar asidi saf suya ve bir asetat karışımına ekleyip pH değişimlerini yan yana koyacak, sonra kapasitenin neye bağlı olduğunu, seyreltmenin neyi değiştirip neyi değiştirmediğini göreceğiz. Son bölümde Tuna'nın şişelerinin mikrobiyolojinin fişine neden uymadığını pKa üzerinden bulacağız.

Metin

Bir çiftin iki yarısı

Modülün ilk dersinde her Brønsted–Lowry asidinin proton verdikten sonra geride bir eşlenik baz bıraktığını görmüştük. pKa dersinde ise pH ile pKa eşitken bu iki formun eşit derişimde bulunduğunu yazmıştık. Tampon, bu iki formun aynı kapta bilerek yüksek derişimde tutulmasıdır.

Asetik asit ile sodyum asetat bu tanıma uyar: şişelerden biri çiftin asidik, öteki bazik yarısını getirir. Sodyum iyonu seyirci kalır ve hesaba girmez.

Hidroklorik asit ile sodyum klorürün karışımı ise uymaz. Hidroklorik asit suda neredeyse tümüyle iyonlaşan güçlü bir asittir. Bu yüzden eşlenik bazı olan klorürün protonu geri alma eğilimi ölçülemeyecek kadar küçüktür. Kaba eklenen hidronyumu karşılayacak bir bazik yarı yoktur; her yeni hidronyum çözeltide olduğu gibi kalır. Böyle bir çözelti ancak zaten çok asidik olduğu için küçük eklemelerden az etkilenir. Litrede 0,10 mol hidroklorik asit içeren bir çözeltinin pH'ı 1,0'dır ve on kat seyreltilince 2,0'a çıkar; bir tamponun sayısal olarak tutabildiği orta bölgeyi, örneğin 7,4'ü, böyle bir karışımla tutmanın yolu yoktur.

Eklenen asit nereye gidiyor

Bir litrelik bir kapta hem asetik asidin hem asetatın derişimi litrede 0,10 mol olsun. Molarite dersinde litrede mol sayısının hacimle çarpılınca madde miktarını verdiğini görmüştük; burada kapta her iki formdan 0,10'ar mol vardır. Oran bir olduğu için pH, pKa'ya eşit olan 4,76'dır.

Şimdi kaba 0,010 mol hidroklorik asit ekleyelim ve hacim değişimini ihmal edelim. Gelen hidronyum, ortamdaki en güçlü baz olan asetatla karşılaşır ve tepkime neredeyse tamamen sağa gider:

H₃O⁺ + CH₃COO⁻ → CH₃COOH + H₂O

Mol muhasebesi basittir. Asetat 0,10 − 0,010 = 0,090 mole iner, asetik asit 0,10 + 0,010 = 0,110 mole çıkar. Eklenen hidronyum ortadan kalkmış değildir; bir asetik asit molekülünün içine yerleşmiştir. Çözeltide serbest kalan hidronyumu bu yeni oran belirler.

Asitlik sabitinin tanımı yeniden düzenlenince [H₃O⁺] = Ka × [HA] ÷ [A⁻] elde edilir. Aynı hacimde derişim oranı mol oranına eşit olduğu için 0,110 ÷ 0,090 ≈ 1,222 yazılır ve hidronyum 1,75 × 10⁻⁵ × 1,222 ≈ 2,14 × 10⁻⁵ mol/L olur. pH 4,76'dan 4,67'ye iner; değişim 0,09 birimdir. Harvey'in analitik kimya kitabı aynı durumu asetatın yüzde onunun asetik aside çevrildiği bir örnekle anlatır ve aynı iki sayıya ulaşır.

Yük dengesini ve suyun iyonlaşmasını hiçbir şey ihmal etmeden hesaba katan tam çözüm de 4,67 verir. Bunun nedeni, serbest hidronyumun litrede yüz binde iki mol düzeyinde kalmasıdır; tamponun içindeki onda birlik molların yanında bu, muhasebeyi bozmayacak kadar küçüktür.

Aynı damla saf suda

Karşılaştırma için aynı 0,010 mol hidroklorik asidi bir litre saf suya ekleyelim. Karşılayacak bir baz olmadığından hidronyumun tamamı serbest kalır: 0,010 ÷ 1,0 = 0,010 mol/L ve pH 2,00'dır. Başlangıçtaki yaklaşık 7'den beş birimlik bir düşüş söz konusudur. pH Ölçeği dersinde kurduğumuz bir birim eşittir on kat kuralıyla okununca hidronyum yüz bin kat artmıştır. Tamponlu kapta ise aynı ekleme hidronyumu yalnızca 1,22 katına çıkarmıştır.

Tampon bir bazı ters yönden de aynı biçimde karşılar. Kaba 0,010 mol sodyum hidroksit eklenirse hidroksit asetik asitten bir proton alır. Asetik asit 0,090 mole iner, asetat 0,110 mole çıkar ve pH 4,84'e yükselir. İki yöndeki değişim neredeyse simetriktir, çünkü başlangıçta iki yarı eşit büyüklüktedir.

Kapasiteyi ne belirliyor

Bir tamponun taşıyabileceği yük iki şeye bağlıdır: kapta toplam kaç mol tampon bulunduğuna ve iki yarının birbirine oranına.

Oranın etkisini görmek için toplamı aynı tutalım: kapta yine 0,20 mol tampon olsun, ama bu kez 0,18 mol asetik asit ve yalnız 0,02 mol asetat bulunsun. pH yaklaşık 3,80'dir, yani pKa'nın bir birim kadar altındadır. Aynı 0,010 mol hidroklorik asit asetatı 0,01 mole indirir, asetik asidi 0,19 mole çıkarır. Oran 0,18 ÷ 0,02 = 9'dan 0,19 ÷ 0,01 = 19'a fırlar; pH 3,48'e iner ve değişim 0,32 birim olur. Toplam mol aynı olduğu hâlde değişim eşit oranlı karışımdakinin üç buçuk katından fazladır, çünkü küçük kalan bazik yarı eklenen asidin yükünü tek başına taşımak zorunda kalmıştır.

Kapasite en büyük değerine iki yarı eşitken, yani pH pKa'ya eşitken ulaşır. Wikipedia'nın tampon çözelti maddesi, pH pKa'dan bir birim uzaklaştığında kapasitenin en büyük değerin üçte birine düştüğünü yazar. Bu oranı, bazın pH'a göre türevini sayısal olarak alarak yeniden hesapladık ve aynı sonuca ulaştık. Harvey'in kitabı da tamponun pKa ± 1 aralığında iş gördüğünü söyler.

Seyreltmek oranı değil, yedeği değiştirir

Stok çözeltilerle çalıştığımız derste (L02-P06-M03-D07) bir çözeltiyi on kat seyreltmenin her derişimi aynı faktörle böldüğünü görmüştük. Tamponda iki yarının derişimi birlikte bölünür ve oranları yerinde kalır. 0,10'ar mollük tampon on kat seyreltilince 0,010 ÷ 0,010 = 1 olur ve pH yine yaklaşık 4,76'dır. Tam çözümde bile pH 4,757'den 4,758'e, yani ancak üçüncü ondalıkta oynar. Hidroklorik asit çözeltisinde aynı seyreltme pH'ı bir birim yükseltmişti; tamponun seyreltmeye bu dayanıklılığı, laboratuvarda bir stok tampondan farklı derişimlerde çalışma çözeltisi hazırlanabilmesinin nedenidir.

Kapasite ise seyreltmeyle birlikte düşer, çünkü kaptaki mol sayısı azalmıştır. Seyreltilmiş tampondan bir litre alalım; içinde yalnız 0,010'ar mol asetik asit ve asetat vardır. Buna 0,0050 mol hidroklorik asit eklenince oran 0,015 ÷ 0,005 = 3 olur ve pH yaklaşık 4,28'e iner. Aynı ekleme seyreltilmemiş tamponda pH'ı yalnız 4,71'e düşürürdü. Eklenen asit 0,010 mole çıkarsa asetatın tamamı tükenir. Geriye litrede 0,020 mol asetik asit ile seyirci iyonlar kalır ve ikinci dereceden denklemle pH 3,23 bulunur; tek bir eklemeyle bir buçuk birimlik bir düşüş olur. Aynı miktar, on kat derişik tamponda 0,09 birimlik bir kıpırtıya yol açmıştı.

Bu ayrım laboratuvarda pratik bir soruya dönüşür: tamponun pH'ını oran belirler, ne kadar yük kaldırabileceğini ise toplam derişim. Bir tarifte yalnız "pH 7,4 fosfat tamponu" yazıyorsa derişim eksik kalmış demektir.

pKa'ya göre seçmek

Tuna'nın şişelerine dönelim. Asetat çiftinin pKa'sı 4,76'dır ve mikrobiyolojinin istediği 7,4 bundan 2,6 birim yukarıdadır. Ka ifadesi bu pH'ta asetatın asetik aside oranını yaklaşık on üzeri 2,64, yani 440'a bir verir. Kapta asidik yarı neredeyse hiç kalmaz ve eklenecek bir baz karşısında tampon yok gibidir. Bu pH'a bu karışımla ulaşmak mümkündür, ama elde edilen çözelti tampon gibi davranmaz.

Fosforik asidin ikinci basamağı ise tam aradığımız yerdedir. pKa dersinde bu basamak için Wikipedia'dan 7,20, LibreTexts'ten 7,21 değerini almıştık. pH 7,40'ta HPO₄²⁻'nin H₂PO₄⁻'ye oranı on üzeri 0,20, yaklaşık 1,6 olur. İki yarı aynı büyüklük düzeyindedir ve karışım pKa ± 1 aralığının içinde kalır. İstek fişinin fosfat istemesi bu yüzden rastlantı değildir.

Biyokimya laboratuvarlarında fosfatın yanında bir aile daha yaygındır. Norman Good ve beş arkadaşı 1966'da Biochemistry dergisinin 5. cildinde (467–477. sayfalar) biyolojik araştırmalar için hidrojen iyonu tamponlarını sistemli biçimde önerdiler. Wikipedia'nın bu tamponlar üzerine maddesi, aradıkları özellikler arasında pKa'nın 6 ile 8 arasında olmasını, suda iyi çözünmeyi, hücre zarından kolay geçmemeyi ve biyokimyasal tepkimelere karışmamayı sayar. Bunlardan HEPES'in pKa'sı Wikipedia'nın tampon çözelti maddesinde 25 °C için 7,48, Good tamponları maddesinde 20 °C için 7,55 olarak verilir. MES için iki madde de 6,15 yazar. İki HEPES değeri arasındaki fark, pKa dersinde gördüğümüz sıcaklık etkisinin küçük bir örneğidir: bir tampon, ölçüldüğü sıcaklığın pKa'sıyla seçilir.

pH Ölçeği dersinde pH metreyi iki tamponla kalibre etmiştik. Kalibrasyon çözeltileri de aynı mantıkla hazırlanır: pH'ı bilinen ve küçük bir kirlenmeyle kolayca kaymayan tampon karışımlarıdır.

Vücuttaki tamponlar

Hücrelerin içinde fosfat yine önemli bir tampon çiftidir, çünkü ikinci pKa'sı hücre içi pH'a yakın düşer. Kanda ise üç tampon ailesi birlikte çalışır: bikarbonat, proteinler ve fosfat. Bikarbonatın özelliği, çiftin asidik yarısının karbon dioksit olarak akciğerden atılabilmesi ve bazik yarının böbrekte ayarlanabilmesidir; bu açık sistemi modülün bikarbonata ayrılan dersi açacak. Hemoglobin ve plazma proteinlerinin yan zincirlerindeki gruplar da proton alıp verir; onların payını proteinlere ayrılan ders tartacak. Buradaki asetat hesabı bu sistemlerin hiçbirinin sayılarını vermez; yalnız hepsinin üzerine kurulduğu mol muhasebesini gösterir.

Fişin arkasına yazılanlar

Seher Hanım iki şişeyi tezgâhın ucuna, depoya dönecekler rafına koyuyor. Tuna istek fişini çevirip arkasına üç satır yazıyor: "Asetat pKa 4,76, 7,4'e uzak. Fosfat ikinci pKa 7,2, uygun. Derişim yazılmamış, sorulacak." Mikrobiyolojiye telefon açıldığında karşı taraf toplam derişimi söylüyor. Tuna o sayıyı fişin üstüne, pH'ın yanına ekliyor ve depo siparişine fosfat tuzlarını yazıyor.

Kendini sına

1. Bir litrede 0,20 mol asetik asit ve 0,20 mol asetat bulunan tampona 0,020 mol hidroklorik asit ekleniyor. Tepkimeden sonra iki formun mol sayısını ve pH'ı hesapla.
2. Aynı 0,020 mol hidroklorik asit bir litre saf suya eklenirse pH ne olur? İki sonucu hidronyumun kaç kat arttığı üzerinden karşılaştır.
3. Hidroklorik asit ile sodyum klorür karışımı neden tampon sayılmaz? Cevabında eşlenik bazın proton alma eğilimini kullan.
4. Bir tampon on kat seyreltiliyor. pH'ı neden neredeyse değişmez? Kapasitesine ne olur ve bunu bir sayısal örnekle göster.
5. pH 6,2'de çalışacak bir deney için MES, HEPES ve asetat arasından hangisini seçersin? Gerekçeni pKa ± 1 uzlaşımıyla açıkla ve bu uzlaşımın neden bir kural değil bir tercih olduğunu yaz.

Bir sonraki derse köprü

Mikrobiyolojinin fişi için yapılan her hesapta pH'ı Ka ile iki formun oranının çarpımından, sonra logaritmadan geçerek bulduk. Aynı iki adımı tek bir satırda birleştirmek mümkün mü? Henderson–Hasselbalch Denklemi dersinde, pH = pKa + log ([A⁻] ÷ [HA]) biçiminin Ka tanımından nasıl türediğini, log oranının sıfır, artı bir ve eksi bir olduğu noktaların ne anlattığını ve bu kısayolun hangi derişimlerde yanıltmaya başladığını soracağız.