Seyreltme Hesabı

Açılış sahnesi

Analizörün numune rafına küçük bir kap yerleştiren Sarp, içine geçen hafta reaktif tezgâhında hazırladığı kalsiyum klorür jojesinden birkaç damla koymuştu. Amacı basitti: etikete yazdığı litrede onda bir molün cihazda da görünüp görünmediğini denetlemek. Pazartesi öğleye doğru sonuç ekrana düştüğünde bir sayı yerine bir uyarı çıktı: "aralık üstü". Cihaz ölçmüş, ama okuduğu sinyali güvendiği bölgenin dışında bulduğu için bir derişim yazmayı reddetmişti.

Vesile Hanım uyarıya şaşırmadı; jojedeki çözelti, kanda ölçülen kalsiyumun onlarca katı derişikti. Sarp'a iki iş verdi. Önce jojeyi cihazın okuyabileceği bir düzeye indirip ölçtürecek, çıkan sayıyı geri çarparak jojenin kendi derişimini bulacaktı. Sonra aynı jojeden, yarın sabahki iç kontrol denemesi için yüz mililitrelik bir çalışma çözeltisi hazırlayacaktı.

Bu derste ne olacak

Seyreltmede neyin değişmeden kaldığını bulup iyi bilinen eşitliği oradan türeteceğiz ve Sarp'ın çalışma çözeltisi için alacağı hacmi hesaplayacağız. Ardından seyreltme faktörünü tanımlayıp laboratuvarlarda iki farklı anlamda okunan "1:10" gösteriminin nasıl bir hataya yol açtığını göreceğiz. Jojeyi analizöre uygun düzeye iki basamakta indirip toplam faktörü çarpımla bulacak, ekrandaki sonucu faktörle geri çarpacağız. Son olarak pipetlerin küçük hatalarının derişime nasıl taşındığını ve basamaklar boyunca nasıl biriktiğini hesaplayacağız.

Metin

Korunan büyüklük

Molarite dersinde (L02-P06-M03-D03) derişimi madde miktarının çözelti hacmine bölümü olarak tanımlamıştık. Bu bağıntıyı ters çevirmek seyreltmenin bütün hesabını verir: bir hacim çözeltideki madde miktarı, derişim ile hacmin çarpımıdır, n = C × V. Bir çözeltiden belirli bir hacim alıp üstünü saf çözücüyle tamamladığımızda kaba eklenen tek şey çözücüdür. Alınan kısmın taşıdığı mol sayısı yeni kapta aynen durur, yalnız daha büyük bir hacme yayılır.

Alınan kısımdaki madde miktarı C₁ × V₁, yeni kaptaki madde miktarı C₂ × V₂ olduğuna ve seyreltme sırasında hiç madde kaybolmadığına göre iki çarpım eşittir: C₁V₁ = C₂V₂. Eşitliğin arkasında bir deney kuralı değil, aynı taneciklerin iki farklı hacimde yapılmış sayımı vardır.

Sarp'ın ikinci görevine uygulayalım. Stok litrede 100,0 milimol, istenen çalışma çözeltisi litrede 2,000 milimol, hedef hacim ise 100,0 mililitre. Eşitliği alınacak hacim için çözünce V₁ = C₂V₂ ÷ C₁ olur: 2,000 × 100,0 ÷ 100,0 = 2,000 mililitre. Sarp stoktan iki mililitre alıp yüz mililitrelik bir jojeye aktaracak ve jojeyi çizgisine kadar suyla tamamlayacak. Ters yönden sınama da aynı sonucu verir: 0,1000 × 2,000 ÷ 100,0 = 0,002000 mol/L. Burada tek tuzak birimlerdir; iki tarafta da derişim aynı birimle, hacim aynı birimle yazılmalıdır, yoksa sonuç binlerce kat kayar.

Faktör ve "1:10" gösterimi

Bir seyreltmeyi tek sayıyla anlatmanın yolu, derişimin kaç kat azaldığını söylemektir.

Çalışma çözeltisi için faktör 100,0 ÷ 2,000 = 50'dir. Sorun bu sayıyı kısaltarak yazarken başlar. Tıbbi laboratuvar öğrencileri için yazılmış açık erişimli bir hematoloji kitabı "1:10 seyreltme" ifadesini on kısım toplamın içinde bir kısım numune diye okur: bir kısım numune ve dokuz kısım seyreltici. Wikipedia'nın seyreltme oranı maddesi ise aynı iki nokta üst üste gösterimini bir kısım çözünene karşılık o kadar kısım çözücü olarak tanımlar; o okunuşta "1:5" beş değil altı kısım toplam demektir. Lab Medicine blogundaki yazı, kesir yazımı olan 1/10 ile oran yazımı olan 1:10'un eşit olmadığı hâlde laboratuvarda birbirinin yerine kullanıldığını vurgular.

Tek bir uzlaşım yoktur. Klinik laboratuvar öğretiminde "bir bölü toplam" okunuşu yaygındır; kimya ve endüstri metinlerinde "bir kısma karşı şu kadar kısım" okunuşu da yaşar. Farkın bedeli küçük faktörlerde büyüktür. Bir basamağı 1+9 yerine 1+10 hazırlayan kişi on bire bölmüş olur ve sonucu on ile çarptığında 11 ÷ 10 = 1,1 oranında, yani yüzde on eksik bir derişim bildirir. Yüz katlık bir seyreltmede aynı karışıklık yüzde bire iner, ama kaybolmaz.

Merdivenle inmek

Stoğu analizöre ölçtürmek için de elli katlık bir indirme gerekiyordu, ama Vesile Hanım bunu tek adımda değil iki adımda yaptırdı. Önce yüz mikrolitre stoğu dokuz yüz mikrolitre suyla bir tüpte karıştırdı; bu tüpün faktörü (100 + 900) ÷ 100 = 10'dur ve derişimi litrede on milimole iner. Sonra bu tüpten iki yüz mikrolitre alıp sekiz yüz mikrolitre suyla karıştırdı; ikinci basamağın faktörü 1000 ÷ 200 = 5'tir.

İki basamağın toplamı 10 × 5 = 50 eder ve ikinci tüp litrede iki milimol kalsiyum taşır. Bu örnekte doğrudan yol da mümkündü: yirmi mikrolitre stok, dokuz yüz seksen mikrolitre suyla tek adımda aynı faktörü verir. Merdivenin asıl gerekçesi büyük faktörlerdedir. Bin katlık bir indirme tek adımda bir mikrolitre almayı gerektirir ve ISO 8655-2 tablosunda bir mikrolitrelik pipet için izin verilen sistematik hata yüzde beştir, yüz mikrolitrede ise yüzde 0,8. Birkaç orta boy basamak, pipetin rahat çalıştığı hacimlerde kalmayı sağlar.

Çarpım kuralının logaritmadaki karşılığı toplamdır. Logaritma dersinde (L02-P01-M02-D04) antikor titrelerinin seyreltme basamaklarıyla okunduğunu ve basamakların katlanarak ilerlediğini görmüştük. On tabanında on katlık basamak bir birim, beş katlık basamak yaklaşık 0,70 birimdir; ikisinin toplamı olan 1,70 da elli katın logaritmasıdır. Wikipedia'nın seri seyreltme maddesi on katlık basamağa "log seyreltme", √10 ≈ 3,16 katlık basamağa "yarım log seyreltme" adını verir. Sabit faktörlü bir seri, logaritmik eksende eşit aralıklı noktalar üretir.

Ekrandan jojeye geri dönüş

İkinci tüp analizörün okuyabildiği bölgeye düştü ve ekran bu kez bir sayı gösterdi: litrede 1,99 milimol. Bu, jojenin değil tüpün derişimidir; jojeye dönmek için seyreltmeyi tersine çevirmek, yani sonucu toplam faktörle çarpmak gerekir: 1,99 × 50 = 99,5 milimol/litre. Sarp'ın etiketteki 100,0 değeriyle arada binde beşlik bir fark kalıyor.

Aralığın üstüne çıkan numunelerde birçok analizör bu işi kendisi yapar: numuneyi önceden tanımlanmış bir faktörle seyreltir, yeniden ölçer, sonucu faktörle çarpar ve raporda seyreltme yapıldığını belirtir. Otomatik ya da elle, geri çarpma iki varsayıma yaslanır. Seyreltilen numunenin sinyali derişimle orantılı kalmalı ve seyreltici ölçülen maddeden hiç taşımamalıdır; kalsiyum ölçerken kullanılan suyun kendisi kalsiyum içeriyorsa, faktörle çarpılan sonuç o katkıyı da elli kez büyütür. Laboratuvarlar bu yüzden bir seyreltme protokolünü bilinen derişimli örneklerle doğrulamadan rutine almaz.

Hatanın yolculuğu

Binde beşlik farkın bir yanlışlık olup olmadığını anlamak için sürecin kendi hata payını bilmek gerekir. Molarite dersinde tanımladığımız göreli hata burada da aynı biçimde işler: çarpma ve bölmeyle kurulan bir hesapta her girdinin göreli sapması sonuca taşınır. Bir seyreltme basamağının faktörü iki hacmin oranıdır, dolayısıyla her iki pipetleme de faktöre kendi göreli hatasını ekler.

ISO 8655-2:2002'nin birinci tablosu hava yastıklı pipetler için yüz ile bin mikrolitre arasındaki anma hacimlerinde rastgele hata sınırını yüzde 0,3, sistematik hata sınırını yüzde 0,8 olarak verir. Bunlar bir pipetin gerçek başarımı değil, uygunluk için üst sınırlardır. Aynı standart, ayarlanabilir bir pipette sınırın anma hacminin mutlak değeriyle bütün aralığa uygulandığını söyler. Bin mikrolitrelik bir pipet yüz mikrolitreye ayarlanırsa, üç mikrolitrelik rastgele sınır yüzde üçe dönüşür; hacme uygun pipeti seçmek bu yüzden hesabın bir parçasıdır.

Birbirinden bağımsız rastgele hatalar düz toplanmaz. Kısmen birbirini götürdükleri için birleşik göreli hata, göreli hataların karelerinin toplamının kareköküyle yaklaşık olarak bulunur. Wikipedia'nın maddesi ve NIST'in teknik notu bu kuralı küçük hatalar için geçerli birinci dereceden bir yaklaşım olarak verir. Her pipetlemenin rastgele göreli hatasını sınır değeri olan yüzde 0,3 kabul edelim. Bir basamak için √(0,3² + 0,3²) ≈ 0,42, iki basamak için √(0,42² + 0,42²) ≈ 0,60 yüzde bulunur. Bu kaba bir üst tahmindir, çünkü seyreltici hacmi faktörün hem payında hem paydasında yer aldığı için katkısı biraz daha küçük çıkar.

Sarp'ın binde beşi, yani yüzde 0,5'i, yalnız pipetlemeden beklenebilecek dağılımın içinde kalıyor; üstelik analizörün kendi tekrarlanabilirliği ve jojenin hazırlanmasındaki tartım hatası bu hesaba henüz girmedi. Tek ölçüm jojenin yanlış hazırlandığını göstermez. Sistematik hata için durum farklıdır. Aynı pipet her basamakta aynı yönde fazla çekiyorsa sapma birbirini götürmez: iki basamakta 0,8 + 0,8 = 1,6 yüzdeye kadar birikebilir, kareler toplamının verdiği 1,13 değil. Seri uzadıkça bağımsız hatalar basamak sayısının karekökü hızında, ortak bir sapma ise basamak sayısıyla doğru orantılı büyür.

Hacimler toplanmadığında

Merdivenin hesabında yüz ile dokuz yüz mikrolitrenin bin mikrolitre ettiğini varsaydık. Yüzde konsantrasyon dersinde eşit hacimde etanol ile suyun karışınca iki hacmin toplamından daha az yer kapladığını görmüştük; derişik çözeltilerde ve bazı çözücü çiftlerinde hacimler toplanmaz. Seyreltik sulu bir tuz çözeltisinde bu sapma pipet hatalarının çok altında kalır ve ihmal edilebilir. Derişik bir stoğu seyreltirken güvenli yol, son hacmi bir toplama değil jojenin çizgisine bırakmaktır: V₂ ölçülen bir hacim olur, iki hacmin toplamı olarak varsayılmaz.

Derişimin başka yazımları da aynı faktörle küçülür. Kütle/hacim yüzdesi ve osmolarite seyreltmede faktöre bölünür; osmolalite ise yalnız yaklaşık olarak bölünür, çünkü osmotik katsayı derişimle değişir ve seyreltilen tuz çözeltisinde bire biraz daha yaklaşır.

Rafa dönen joje

Sarp ikinci tüpün etiketine üç satır yazıyor: "stok, 1+9, sonra 1+4", "toplam faktör 50", "okunan 1,99 → 99,5". Kendi hazırladığı çalışma jojesinin etiketine de "2,000 mL stok, 100,0 mL'ye tamamlandı" satırını ekliyor. Vesile Hanım "1:10" yazmadığı için onu kutluyor ve stok jojeyi dolaptaki yerine geri koyuyor.

Atık tüpleri toplarken Sarp bin katlık bir indirmenin kaç basamakla, hangi pipetlerle yapılacağını kafasında kurmaya başlıyor. Cevabı artık hacimlerden değil hatalardan başlatması gerektiğini biliyor.

Kendini sına

1. Litrede 0,5000 mol olan bir stoktan 250,0 mililitrelik ve litrede 0,02000 mol olan bir çözelti hazırlamak için stoktan kaç mililitre alınır? Seyreltme faktörü nedir?
2. Bir talimat "1:4 seyrelt" diyor. İki okunuşa göre toplam faktörü yaz ve yanlış okunuşla geri çarpılan sonucun yüzde kaç sapacağını hesapla.
3. Üç basamaklı bir seri seyreltmenin faktörleri 10, 10 ve 4'tür. Toplam faktörü ve bunun on tabanında logaritmasını bul.
4. Analizör seyreltilmiş bir numunede litrede 3,40 milimol okuyor ve toplam faktör 20. Numunenin kendi derişimi nedir? Geri çarpmanın dayandığı iki varsayımı yaz.
5. Her pipetlemenin göreli hatası yüzde 0,5 kabul edilirse, iki pipetlemeli üç basamaklı bir serinin birleşik göreli hatasını kareler toplamıyla kabaca tahmin et. Aynı pipetin ortak bir sapması bu tahmini neden bozar?
6. Derişik bir stok ile su karıştırılırken son hacmi neden toplamayla değil jojenin çizgisiyle belirlemek gerekir?

Bir sonraki derse köprü

Seyreltmenin her adımını Sarp'ın elinden izledik. Klinik Çözelti Hesapları dersinde kalem okura geçecek: bir çözeltinin etiketindeki yüzde değerini mol/L'ye, mol/L'yi miliosmole çevirip bir seyreltmenin ardından geri çarpılan sonuca kadar giden zinciri kurarken, modül boyunca tanıdığın birimlerin hangisi hangi basamakta kullanılmalı ve zincirin hangi halkası en büyük hatayı taşır?