Biyoteknoloji

Ravza ödev posterinin başlığını yazmış: «Biyoteknoloji: Geleceğin Bilimi». Altına beyaz önlüklü insanlar, pipetler, ışıklı cihazlar çizecek; ona göre bu iş yalnız pahalı makinelerle dolu laboratuvarlarda yapılan, birkaç on yıllık bir buluş. O sırada mutfakta annesi ılıttığı sütün içine bir kaşık dünkü yoğurdu karıştırıyor, tencereyi kalın bir örtüye sarıp sabaha bırakıyor. Ravza nedenini soruyor. Annesi kısa cevap veriyor: «O bir kaşık yoğurt olmazsa süt sabaha yoğurt olmaz, bozulur.» Ravza kaşıktaki yoğurtta gözle görünmeyen milyonlarca bakteri olduğunu kitaptan hatırlıyor. Sabah tencerede koyulaşmış yoğurdu görünce posterine bakıyor: annesinin yaptığı da canlılardan yararlanarak bir ürün elde etmek değil mi? Öyleyse laboratuvarda yapılanı mutfaktakinden ayıran nedir?

• Geleneksel ve modern biyoteknoloji örneklerini kullandıkları yönteme göre ayırırsın.
• Kesici enzim, DNA ligaz ve vektörün görevlerini rekombinant DNA basamaklarına yerleştirirsin.
• PCR döngüsünün basamaklarını açıklar, verilen döngü ve başlangıç sayısından kopya sayısını hesaplarsın.
• DNA parmak izi ve çekirdek aktarımıyla klonlama sonuçlarını genetik benzerlik açısından yorumlarsın.

Mutfaktaki eski ortaklık

Ravza'nın annesinin yaptığı işin bilimsel adı fermantasyondur. Kaşıktaki yoğurtla gelen bakteriler süt şekerini laktik aside çevirir; ortam asitlendikçe süt proteinleri pıhtılaşır ve sıvı koyulaşır. Ekmek hamurunda iş başında olan canlı bir mantardır: «Mantarlar» dersinde gördüğümüz tek hücreli maya, şekeri parçalarken karbon dioksit çıkarır ve kabarcıklar hamuru kabartır. Peynir yapımında ise süt hem bakterilerle hem de sütü pıhtılaştıran bir enzim karışımıyla işlenir; günlük dilde «peynir mayası» denen bu karışım ekmek mayası gibi canlı bir mantar değil, bir enzim hazırlığıdır.

Canlılardan ya da onların hücre ve enzimlerinden yararlanarak insan için ürün ve hizmet üreten bütün uygulamalar biyoteknoloji başlığı altında toplanır. Bu tanıma göre yoğurt mayalayan bir ev de, insan geni taşıyan bakterileri büyük kaplarda üreten bir tesis de biyoteknoloji yapar. Kulağa yeni gelen bu ad, binlerce yıllık bir uğraşı kapsar.

Geleneksel ile modern arasındaki çizgi

Yoğurt, ekmek, peynir, sirke ve turşu geleneksel biyoteknolojinin örnekleridir. Bunlara insanların kuşaklar boyunca istedikleri özellikteki bitki ve hayvanları seçip birbirleriyle çaprazlaması, yani seçici ıslah da eklenir: daha iri taneli buğday ya da daha çok süt veren inek, işe yarayan bireylerin her kuşakta yeniden seçilmesiyle elde edilmiştir. Bu yöntemlerde canlının kalıtsal yapısına doğrudan dokunulmaz; insan yalnız ortamı ve çiftleşmeyi yönetir, hangi genlerin bir araya geleceği eşeyli üremenin karışımına kalır.

«Mutasyonların proteine etkisi» dersinde DNA'daki değişikliklerin kaynağı eşlenme hataları ve mutajenlerdi; hiçbiri bir plana göre olmuyordu. Modern biyoteknolojide ise değişikliği insan planlar ve kalıtım maddesine doğrudan el atar. Bir gen bir canlıdan çıkarılır, başka bir DNA'ya yerleştirilir, istenen hücreye aktarılır ya da laboratuvarda milyonlarca kez çoğaltılır; bir hücrenin çekirdeği bütünüyle başka bir hücreye de taşınabilir. Bu müdahaleleri yapan tekniklerin bütününe genetik mühendisliği denir. Ravza'nın sorusunun cevabı burada: mutfakla laboratuvarı ayıran makinelerin varlığı değil, kalıtım maddesine elle müdahale edilip edilmediğidir.

DNA'yı belirli yerden kesen enzimler

Genetik mühendisliğinin ilk ihtiyacı, uzun bir DNA molekülünden istenen parçayı her seferinde aynı yerden ayırabilmektir. Bu iş kesici enzimlerle, ders kitaplarındaki adıyla restriksiyon enzimleriyle yapılır. Bakterilerde doğal olarak bulunan bu enzimler, hücreye giren virüs DNA'sını parçalayarak bakteriyi korur; bakteri kendi DNA'sını ise kimyasal işaretlerle bu kesimden saklar. «Virüsler» dersinde bakteriyofajların kalıtım maddesini bakteriye enjekte ettiğini görmüştük; kesici enzimler bu saldırıya karşı bakterinin savunmasıdır.

Her kesici enzim yalnız kendine özgü, genellikle dört ile sekiz baz uzunluğunda bir diziyi tanır. Örneğin bir enzim GAATTC dizisini arar. Bu dizinin karşı zinciri de ters yönden okununca yine GAATTC'dir; çoğu tanıma dizisi böyle iki yönden aynı okunur. Enzim iki zinciri de G ile A arasından keser. Kesim noktaları iki zincirde karşı karşıya gelmediği için her parçanın ucunda dört bazlık tek zincirli bir çıkıntı kalır: AATT. Bu çıkıntılara yapışkan uç denir, çünkü aynı enzimle kesilmiş başka herhangi bir DNA'nın ucundaki AATT ile tamamlayıcı bazlar arasında hidrojen bağı kurarak eşleşebilirler. Bazı kesici enzimler ise iki zinciri aynı hizadan keser ve çıkıntısız, düz uçlar bırakır.

Kesimin bu işleyişi iki pratik sonuç doğurur. Birincisi, kesim rastgele değildir: tanıma dizisi bir DNA'da kaç kez geçiyorsa o kadar kesim olur. Doğrusal bir DNA k noktadan kesilince k + 1 parçaya, halkasal bir DNA ise k parçaya ayrılır. İkincisi, iki farklı DNA'yı birbirine eklemek isteyen kişi ikisini de aynı enzimle kesmelidir; ancak o zaman uçlar birbirini tamamlar.

Parçaları kalıcı hâle getiren DNA ligaz

Yapışkan uçlar arasındaki hidrojen bağları zayıftır; parçaları geçici olarak bir arada tutar ama zincirin şeker–fosfat omurgasında hâlâ boşluk vardır. Bu boşluğu, «DNA eşlenmesi» dersinde kesintili zincirin parçalarını birleştirdiğini gördüğümüz DNA ligaz kapatır: komşu nükleotitler arasında fosfodiester bağı kurar. Kesici enzimin kopardığı bağ ile ligazın kurduğu bağ aynı türdendir; biri açar, öbürü yeniden kilitler.

Geni hücreye taşıyan araçlar

Bir geni bir hücreye çıplak olarak vermek çoğu zaman sonuç vermez; gen hücrede çoğalmaz ve kaybolur. Geni hedef hücreye taşıyan ve orada çoğalmasını sağlayan DNA'ya vektör denir. En sık kullanılan vektör, «Bakteriler ve arkeler» dersinde tanıdığımız plazmittir. Plazmit bakterinin ana kromozomundan bağımsız olarak kendi kendine eşlenir ve bakteri bölündükçe yavru hücrelere de geçer. Birçok plazmit antibiyotiğe direnç sağlayan genler taşır; bu özellik birazdan seçim basamağında işe yarayacak. Plazmitlerin yanı sıra hastalık yapma yetenekleri giderilmiş virüsler de vektör olarak kullanılır; virüslerin hücreye kalıtım maddesi sokma becerisi burada geni taşımak için değerlendirilir.

Rekombinant DNA adım adım

Farklı kaynaklardan gelen DNA parçalarının birleştirilmesiyle kurulan moleküle rekombinant DNA denir. Bir insan genini bakteride çalıştırmak için izlenen yol şöyledir:

1. İstenen geni taşıyan DNA ile plazmit aynı kesici enzimle kesilir. Plazmit halkası bir noktadan açılır, gen de iki ucunda yapışkan çıkıntılarla ayrılır.
2. Gen ile açılmış plazmit karıştırılır; yapışkan uçlar tamamlayıcı bazlarla eşleşir.
3. DNA ligaz omurgadaki boşlukları kapatır ve gen plazmit halkasının kalıcı bir parçası olur.
4. Rekombinant plazmitler bakterilerle aynı ortama konur; bazı bakteriler plazmidi içeri alır. Bakterinin dışarıdan DNA alması olayına transformasyon denir.
5. Bakteriler antibiyotikli besiyerine ekilir. Plazmitteki direnç geni yalnız plazmit almış bakterileri yaşatır; plazmit almayanlar ölür. Bu seçim plazmidi alanları ayırır ama her plazmidin içinde istenen genin bulunduğunu garanti etmez; bu yüzden genin varlığı ayrıca denetlenir.
6. Seçilen bakteriler çoğaltılır. Her bölünmede plazmit de eşlenir; böylece gen milyonlarca kez kopyalanmış olur ve bakteriler genin kodladığı proteini üretir.

Bir genin bu yolla çok sayıda özdeş kopyasının elde edilmesine gen klonlama denir. Adı canlı klonlamaya benzese de burada kopyalanan bir canlı değil, bir DNA parçasıdır.

Bakteri bir insan genini nasıl okur

Bakteri ile insan arasında yüz milyonlarca yıllık ayrılık varken bakterinin bir insan genini okuyabilmesi şaşırtıcı görünebilir. Anahtarı «Gen ve genetik kod» dersi vermişti: kod hemen hemen evrenseldir, yani aynı kodon bakteride de insanda da çoğunlukla aynı aminoasidi belirtir. Bakterinin ribozomları insan geninden yazılan mRNA'yı kendi mRNA'larından ayırmadan okur ve aynı aminoasit dizisini kurar.

Bir pürüz var: «Transkripsiyon» dersinde gördüğümüz gibi ökaryot genlerinin çoğu intron taşır ve bakteri bu intronları çıkaramaz. Bu yüzden bakteriye aktarılacak insan geni, intronlarından arındırılmış bir kopya olarak hazırlanır.

PCR: bir damla DNA'dan milyonlarca kopya

Bazen elde çok az DNA vardır: bir kıl kökü, bir damla kurumuş kan. İncelemek için o DNA bölgesinin çok sayıda kopyasına ihtiyaç duyulur, ama her seferinde bakteriye aktarmak zahmetlidir. PCR (polimeraz zincir tepkimesi) bu kopyalamayı canlı hücre kullanmadan bir tüpte yapar. Tüpe kopyalanacak DNA, dört çeşit serbest nükleotit, çoğaltılacak bölgenin iki ucuna uyan kısa tek zincirli DNA parçaları (primerler) ve ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz konur. Sonra tüp, sıcaklığı döngüsel olarak değiştiren bir cihaza yerleştirilir. Her döngü üç basamaklıdır:

Hücredeki eşlenmede zincirleri helikaz ayırırken PCR'da bu işi ısı yapar. Sıradan bir DNA polimeraz ilk döngüdeki yüksek sıcaklıkta bozulurdu; bu yüzden sıcak su kaynaklarında yaşayan bir bakteriden elde edilen ısıya dayanıklı bir polimeraz kullanılır. Primerler de gereklidir, çünkü DNA polimeraz sıfırdan zincir başlatamaz; ancak var olan bir ucu uzatabilir.

Her döngüde tüpteki her çift zincirli molekül açılır ve iki yeni molekül olur, yani kopya sayısı ikiye katlanır. Başlangıçta N₀ molekül varsa, her döngü tam verimle çalıştığında n döngü sonra kuramsal olarak N₀ · 2ⁿ molekül bulunur. Tek bir molekülden otuz döngüde 2³⁰, yani yaklaşık bir milyar kopya çıkar. Gerçek tepkimede verim kusursuz olmadığı ve malzeme tükendiği için sayı bu tavanın altında kalır. PCR adli tıpta, hastalık etkenlerinin tanısında ve araştırmada az miktardaki DNA'yı çalışılabilir hâle getirmek için kullanılır.

DNA parmak izi

İki insanın DNA dizisi büyük ölçüde aynıdır, ama bazı bölgelerde, özellikle kısa dizilerin art arda tekrarlandığı bölgelerde, tekrar sayısı kişiden kişiye değişir. Bu bölgeler kesici enzimlerle kesildiğinde ya da PCR ile çoğaltıldığında her kişide farklı uzunlukta parçalar oluşur. Parçalar jel elektroforezi ile ayrılır: jelin bir ucuna konan DNA, elektrik akımı verilince fosfat grupları yüzünden negatif yüklü olduğundan pozitif kutba doğru ilerler. Jelin gözenekleri küçük parçaları daha az yavaşlattığı için aynı sürede küçük parçalar daha uzağa gider. Sonuçta her kişiye özgü bir bant deseni ortaya çıkar; buna DNA parmak izi denir. Tek yumurta ikizleri dışında iki kişinin deseni pratikte aynı çıkmaz.

Desen kalıtımı da yansıtır. Bir çocuğun bantlarının her biri anneden ya da babadan gelmiş olmalıdır. Varsayımsal bir akrabalık incelemesinde, çocuğun anneyle ortak olmayan bantlarının tamamı aday babada bulunmuyorsa o aday dışarıda kalır.

Canlı klonlama: çekirdek aktarımı

Klon sözcüğü «Eşeysiz üreme» dersinden tanıdık: tek bir atadan mitozla türeyen, kalıtsal olarak özdeş bireyler. Memelilerde böyle bir doğal yol yoktur; bir memeliyi klonlamak için çekirdek aktarımı kullanılır. 1996'da doğan Dolly koyunu bu yöntemle yetişkin bir hücreden klonlanan ilk memelidir. Basamaklar şunlardır:

1. Klonlanacak bireyden bir vücut hücresi alınır; Dolly'de bu, yetişkin bir koyunun meme bezi hücresiydi.
2. Başka bir dişiden alınan yumurta hücresinin çekirdeği çıkarılır.
3. Vücut hücresinin çekirdeği bu çekirdeksiz yumurtaya aktarılır; hücre bölünmeye uyarılır ve embriyo gelişmeye başlar.
4. Embriyo, taşıyıcı bir dişinin rahmine yerleştirilir ve gebelik orada sürer.

Doğan yavrunun çekirdek DNA'sı çekirdeği veren bireyinkiyle aynıdır; yumurtayı veren dişi çekirdek geni katmaz, taşıyıcı dişi ise hiç gen vermez. Yalnız yumurtanın sitoplazmasında kalan mitokondriler kendi DNA'larıyla birlikte yavruya geçer; bu yüzden klonun mitokondri DNA'sı büyük ölçüde yumurtayı veren dişiden gelir. Çevre koşulları da fenotipi etkilediğinden klon, çekirdeği veren bireyin her bakımdan aynısı olmaz.

Kesme, birleştirme, taşıma, çoğaltma ve kopyalama araçları elde olunca asıl soru bunlarla ne yapılacağıdır. Bir bitkiye başka bir türden direnç geni kazandırmak, bozuk bir genin işini insan hücresinde yerine koymaya çalışmak, bir hormonu bakterilere ürettirmek bu araç kutusunun uygulamalarıdır. Sıradaki ders «Genetik mühendisliği uygulamaları», genetiği değiştirilmiş organizmaları, gen tedavisini ve üretimde kullanımı, bu uygulamaların getirdiği yararları ve tartışmaları ele alıyor.

Örnek 1 — Basamakların sırası

Soru: Bir insan geninin bakteride çoğaltılması için şu işlemler yapılacak: bakterilerin antibiyotikli besiyerine ekilmesi; gen ile plazmidin aynı kesici enzimle kesilmesi; rekombinant plazmidin bakteriye aktarılması; DNA ligazın eklenmesi. Doğru sıra hangisidir?

• A) Ligaz, kesme, aktarma, antibiyotikli besiyeri
• B) Kesme, aktarma, ligaz, antibiyotikli besiyeri
• C) Kesme, ligaz, aktarma, antibiyotikli besiyeri
• D) Aktarma, kesme, ligaz, antibiyotikli besiyeri
• E) Antibiyotikli besiyeri, kesme, ligaz, aktarma

Çözüm: Önce yapışkan uçlar oluşturulmalı, yani kesme ilk iştir. Ligaz ancak eşleşmiş uçlar varken boşluk kapatabilir; aktarma da birleştirilmiş plazmitle yapılır. Seçim, aktarmadan sonra hangi bakterilerin plazmit aldığını ayırmak için en sondadır. A ligazı birleştirecek uç yokken çalıştırıyor; B henüz kapanmamış plazmidi aktarıyor; D kesilmemiş geni aktarıyor; E plazmit almamış bakteriler arasında seçim yapmaya çalışıyor. Cevap: C.

Örnek 2 — PCR'da kopya sayısı

Soru: Bir tüpte çoğaltılacak bölgeyi taşıyan 5 DNA molekülü var. Her döngü tam verimle çalışırsa 6 döngü sonunda kuramsal olarak kaç molekül bulunur?

• A) N = 30
• B) N = 64
• C) N = 60
• D) N = 320
• E) N = 15 625

Çözüm: Her döngü sayıyı ikiye katlar: 6 döngüde çarpan 2⁶ = 64'tür ve başlangıçtaki 5 molekülün her biri bu kadar artar, 5 · 64 = 320. A döngü sayısını başlangıçla çarpıyor; C her döngüde yalnız iki molekül eklendiğini sanıyor (5 · 2 · 6). B başlangıçtaki beş molekülü unutuyor. E üssü ve tabanı yer değiştirip 5⁶ hesaplıyor. Cevap: D.

Örnek 3 — Kuzunun genleri kimden

Soru: Varsayımsal bir çalışmada beyaz yüzlü bir koyunun deri hücresinden alınan çekirdek, siyah yüzlü bir koyunun çekirdeği çıkarılmış yumurtasına aktarılıyor; embriyo üçüncü bir koyunun rahminde gelişiyor. Doğan kuzu için hangisi doğrudur?

• A) Çekirdek genleri siyah yüzlü koyundan gelir.
• B) Genlerinin yarısı beyaz yüzlü, yarısı siyah yüzlü koyundandır.
• C) Taşıyıcı koyun kuzuya çekirdek geni verir.
• D) Mitokondri DNA'sı dahil bütün DNA'sı beyaz yüzlü koyunla aynıdır.
• E) Çekirdek DNA'sı beyaz yüzlü koyunla aynıdır; mitokondri DNA'sı büyük ölçüde siyah yüzlü koyundan gelir.

Çözüm: Çekirdek beyaz yüzlü koyundan geldiği için çekirdek genleri ona aittir. Yumurtanın sitoplazması ise mitokondrileri taşır. A çekirdeği yumurtaya bağlıyor; B döllenme varmış gibi genleri bölüştürüyor, oysa burada gamet birleşmesi yok. C rahim ile kalıtımı karıştırıyor. D mitokondrilerin yumurtadan geldiğini atlıyor. Cevap: E.

Örnek 4 — Rastgele kesim sanısı

Soru: Serpil «Kesici enzim bir DNA'yı her denemede farklı noktalardan doğrar; bu yüzden aynı geni iki kez kesip aynı parçayı elde edemeyiz» diyor. Bu düşünceye en güçlü karşı kanıt hangisidir?

• A) Ligazın parçaları birleştirmesi
• B) Aynı enzimin yalnız kendine özgü dizide kesmesi; aynı DNA her seferinde aynı uzunlukta parçalar verir.
• C) Plazmitlerin halkasal olması
• D) PCR'da sıcaklığın döngüsel değişmesi
• E) DNA'nın negatif yüklü olması

Çözüm: Kesici enzim bir tanıma dizisini arar; dizi DNA'da nerede ve kaç kez geçiyorsa kesim de orada ve o kadardır. Bu yüzden aynı DNA aynı enzimle kesildiğinde jelde hep aynı bantlar çıkar; DNA parmak izinin güvenilirliği de buna dayanır. A, C, D ve E doğru bilgiler ama kesimin rastgele olup olmadığıyla ilgili bir şey söylemiyor. Cevap: B.

• Biyoteknolojiyi yalnız laboratuvarla sınırlamak. Yoğurt, ekmek, peynir ve seçici ıslah da biyoteknolojidir; moderni gelenekselden ayıran, kalıtım maddesine ve hücreye doğrudan müdahaledir.
• Kesici enzimin rastgele kestiğini sanmak. Her enzim kendine özgü bir diziyi tanır; kesim sayısı o dizinin DNA'da kaç kez geçtiğine bağlıdır. Doğrusal DNA k kesimde k + 1, halkasal DNA k parçaya ayrılır.
• Ligaza hidrojen bağı kurdurmak. Yapışkan uçlar hidrojen bağlarıyla kendiliğinden eşleşir; ligaz omurgadaki fosfodiester bağını kurar.
• Antibiyotikli besiyerinin istenen geni seçtiğini düşünmek. Direnç geni plazmit taşıyan bakteriyi seçer; plazmidin içinde istenen genin olup olmadığı ayrıca denetlenir.
• PCR hesabında başlangıç sayısını unutmak. Kopya sayısı 2ⁿ değil N₀ · 2ⁿ'dir; n döngüde çarpan n ya da 2n değil, 2ⁿ'dir.
• Klonu taşıyıcı anneye benzetmek. Klonun çekirdek genleri çekirdeği veren bireyden gelir; taşıyıcı gen vermez, mitokondri DNA'sı ise büyük ölçüde yumurtayı verenden gelir.