DNA eşlenmesi

Gülfem cumartesileri mahalledeki kırtasiyenin fotokopi tezgâhında çalışıyor. Sabah bir müşterinin on sayfalık dilekçesini çoğaltırken aklından biyoloji ödevi geçiyor: asıl kâğıt makinenin camında olduğu gibi duruyor, kopya ise tepsiye yepyeni bir sayfa olarak düşüyor. Akşam ödevine notunu yazıyor: «Hücre de bölünmeden önce DNA'sını fotokopi gibi çoğaltır. Asıl molekül bozulmadan bir yavru hücreye geçer, baştan sona yeni olan kopyası öbürüne.» Ertesi gün sıra arkadaşı Hadi, kitabın deney kutusunu açıp ona bir satır gösteriyor: ağır azotla işaretlenmiş DNA'sı olan bakteriler hafif azotlu besiyerinde bir kez bölündüğünde, tüpte ağır DNA'ya ait bir bant hiç görülmemiş; bütün DNA iki uç yoğunluğun tam ortasında toplanmış. Gülfem'in fotokopi modeli doğru olsaydı, camda bozulmadan kalan asıl sayfanın izi tüpün neresinde görünecekti? Görünmediyse eski molekül nereye gitti?

• Eşlenmenin hücre döngüsündeki yerini ve neden bölünmeden önce tamamlanması gerektiğini açıklarsın.
• Üç eşlenme modelinin kuşaklar boyunca vereceği yoğunluk bantlarını öngörür, deney sonucunu bunlarla sınarsın.
• Helikaz, DNA polimeraz ve DNA ligazın görevlerini eşlenme basamaklarına yerleştirirsin.
• Eşlenmede kullanılan nükleotit ile kurulan hidrojen ve fosfodiester bağı sayılarını hesaplarsın.

Bölünmeden önce bilgi neden ikiye katlanmalı

Bir hücre bölündüğünde iki yavru hücrenin her biri, ana hücrenin taşıdığı kalıtsal bilginin eksiksiz bir takımına muhtaçtır. Bilgiyi ikiye paylaştırmak yetmez; önce onu iki katına çıkarmak gerekir. Bu işin interfazın S evresinde yapıldığını ve sonunda her kromozomun sentromerden bağlı iki özdeş kromatit taşıdığını TYT'deki «Hücre döngüsü ve interfaz» konusu göstermişti. «Mitoz» ve «Mayoz» derslerinde de bölünmenin yalnız dağıtıcı olduğu, eşlenmenin bölünme sırasında değil ondan önce gerçekleştiği, mayozun iki bölünmesi arasında da yinelenmediği vurgulanmıştı. Bu derste sorulan soru başka: kopyalama molekül düzeyinde nasıl yürüyor?

Cevabın yarısı «DNA'nın yapısı» dersinden hazır geliyor: A'nın karşısına yalnız T, G'nin karşısına yalnız C oturduğuna göre, elde tek zincir kalsa bile kaybolan eşi harf harf yeniden yazılabilir. Eşlenmenin bütün mantığı bu tamamlayıcılık üzerine oturur.

Üç olası kopyalama biçimi

Çift sarmalın keşfinden sonra eski zincirlerin yeni moleküllere nasıl dağıldığı açık bir soruydu. Akla gelen üç model şunlardı:

• Korunumlu model: Eski molekül bütünüyle korunur; iki yeni zincir kendi aralarında eşleşip baştan sona yeni bir molekül kurar. Gülfem'in fotokopi benzetmesi tam olarak budur.
• Yarı korunumlu model: İki eski zincir birbirinden ayrılır, her biri kendi karşısına yeni bir zincir alır. Oluşan iki molekülün ikisinde de bir zincir eski, öbürü yenidir.
• Dağınık model: Eski molekül parçalara bölünür; yeni moleküllerin her zinciri eski ve yeni parçaların karışımından oluşur.

Üç model de sonunda iki çift sarmal üretir; farkları eski malzemenin nereye gittiğindedir. Hangisinin doğru olduğunu anlamak için eski ve yeni zincirleri birbirinden ayırt edilebilir kılmak gerekiyordu.

Ağır azot ve hafif azot

1958'de Meselson ve Stahl bu ayrımı azot atomlarıyla yaptı. DNA'nın azotlu bazları azot içerir. Azotun yaygın biçimi ¹⁴N'dir; bir nötronu fazla olan ¹⁵N daha ağırdır. Araştırmacılar E. coli bakterilerini uzun süre yalnız ¹⁵N içeren besiyerinde üreterek DNA'larının iki zincirini de ağır azotla işaretlediler. Sonra bakterileri ¹⁴N içeren besiyerine aktardılar ve her bölünmenin ardından örnek alıp DNA'yı ayırdılar.

DNA'lar yoğunluk gradyanı santrifüjüyle ayrıldı: tüpte dipten yukarı doğru yoğunluğu giderek azalan bir tuz çözeltisi vardır. Çok hızlı döndürülen tüpte her DNA molekülü kendi yoğunluğuna eşit olan düzeyde durur ve bir bant oluşturur. İki zinciri de ağır olan DNA dibe yakın, iki zinciri de hafif olan daha yukarıda, bir ağır bir hafif zincir taşıyan melez DNA ise ikisinin arasında toplanır.

Bantlar kuşak kuşak

Deneyin sonucu şöyleydi: hafif ortamdaki ilk bölünmeden sonra tüpte tek bir bant vardı ve bu bant ara yoğunluktaydı. İkinci bölünmeden sonra iki bant görüldü; biri ara, öbürü hafif yoğunluktaydı ve DNA miktarı ikisine eşit dağılmıştı.

Her modelin bu iki kuşak için öngördüğü tabloyu kurmak, sonucu okumanın en güvenli yoludur:

Birinci kuşaktaki tek ara bant korunumlu modeli dışarıda bıraktı, çünkü o modelde eski ağır molekül bozulmadan kalır ve dipte görünmeliydi. Kanca sorusunun cevabı da budur: Gülfem'in kurduğu senaryoda tüpün dibinde bir ağır bant beklenirdi. İkinci kuşaktaki ayrı hafif bant ise dağınık modeli eledi; o modelde her molekül biraz eski malzeme taşıyacağı için tamamen hafif bir molekül oluşamazdı. Geriye yalnız yarı korunumlu eşlenme kaldı.

Kuşak hesabı tek bir kuralla yürür. Bir molekül n kez eşlenirse 2ⁿ molekül oluşur. Başlangıçtaki iki ağır zincir hiçbir zaman parçalanmaz ve bir daha birbirine eşleşmez; her biri hep bir molekülde, bir hafif zincirle eşli kalır. Bu yüzden kaç kuşak geçerse geçsin melez molekül sayısı 2'dir, geri kalan 2ⁿ − 2 molekül tamamen hafiftir. Üçüncü kuşakta sekiz molekülün ikisi melez, altısı hafiftir; melezlerin payı kuşaktan kuşağa yarıya iner ama sayısı değişmez. Deney tersine kurulursa, yani hafif DNA'lı bakteri ağır ortama aktarılırsa, aynı akıl yürütme melez ile ağır bantları verir.

Zincirleri açan enzim: helikaz

Eşlenme, DNA üzerindeki belirli başlangıç noktalarında zincirlerin açılmasıyla başlar. Bu işi helikaz enzimi yapar: karşılıklı bazlar arasındaki hidrojen bağlarını koparır ve iki zinciri fermuar açar gibi birbirinden ayırır. Açılan bölge Y biçiminde bir çatal görünümü alır ve helikaz ilerledikçe çatal da molekül boyunca kayar. Hidrojen bağlarının zayıf, şeker ile fosfat arasındaki omurga bağlarının güçlü olması burada işe yarar: zincirler ayrılırken kendileri kırılmaz, yalnız birbirinden çözülür.

Yeni zinciri uzatan enzim: DNA polimeraz

Açılan iki zincirin her biri artık bir kalıptır. Hücrede serbest hâlde bulunan nükleotitler kalıptaki bazlara tamamlayıcı kurala göre yerleşir: kalıpta A varsa karşısına T, G varsa C gelir. DNA polimeraz enzimi bu nükleotitleri birbirine şeker–fosfat bağlarıyla, yani fosfodiester bağlarıyla ekleyerek yeni zinciri uzatır. Yeni zincirin dizisi kalıbın aynısı değil, tamamlayıcısıdır; kalıbın kopyası ise ancak iki adım sonra, yeni zincirin kalıp olacağı bir sonraki eşlenmede ortaya çıkar.

DNA polimerazın bir yön kısıtı vardır: yeni zinciri yalnız bir ucundan uzatabilir. İki eski zincir birbirine ters yönde uzandığı için çatalın açılış yönüyle iki zincirin durumu farklılaşır. Zincirlerden birinde polimeraz çatalı izleyerek kesintisiz ilerler; öbüründe çatalın tersine çalışmak zorunda kaldığından yeni zinciri kısa parçalar hâlinde, çatal açıldıkça bir parça daha ekleyerek kurar. Bu parçalı zincirin ara boşluklarını DNA ligaz enzimi fosfodiester bağı kurarak kapatır ve parçaları tek bir zincire dönüştürür.

Hatayı yakalayan polimeraz

Eşlenmede milyonlarca nükleotit yerleştirilir ve arada yanlış bir baz da kalıbın karşısına gelebilir. DNA polimeraz eklediği nükleotidin kalıpla doğru eşleşip eşleşmediğini denetler; yanlış eşleşmiş bir nükleotidi çıkarıp yerine doğrusunu koyabilir. Bu denetim sayesinde eşlenme son derece az hatayla tamamlanır, ama hata oranı hiçbir zaman sıfır değildir. Düzeltilemeyen bir değişikliğin genin ürününe ne yaptığı mutasyonların proteine etkisi konusunda ayrıca ele alınacak.

Enerji nereden gelir

Eşlenme kendiliğinden yürüyen bir olay değil, enerji isteyen bir sentezdir. Helikazın hidrojen bağlarını koparıp zincirleri ayırması ATP harcar. Yeni zincire eklenecek nükleotitler ise hücrede üç fosfatlı, yüksek enerjili moleküller olarak bulunur; ATP'ye benzeyen bu öncüller zincire bağlanırken fosfatlarından ikisini bırakır ve bağdan açığa çıkan enerji yeni fosfodiester bağının kurulmasında kullanılır. «Nükleik asitler ve ATP» dersindeki yüksek enerjili fosfat bağı fikri burada iş başındadır. Eşlenmede görev alan helikaz, polimeraz ve ligaz da birer protein olduğundan «Enzimler» dersindeki özelliklere uyar: sıcaklık ve pH gibi koşullardan etkilenir, işlerini tepkimeden değişmeden çıkarak tekrar tekrar yaparlar.

Eşlenmenin sayıları

Yarı korunumlu eşlenme, sayısal soruların da anahtarıdır. Çift zincirli ve doğrusal, 2000 nükleotitten oluşan bir DNA ele alalım; adenin sayısı 600 olsun. Tamamlayıcılık gereği 600 timin vardır; geri kalan 800 nükleotidin yarısı guanin, yarısı sitozindir. A–T çiftleri 600, G–C çiftleri 400 tane olduğundan molekülün hidrojen bağı sayısı 600 · 2 + 400 · 3 = 2400 eder.

• Kullanılan serbest nükleotit: Her yavru molekülde bir zincir yenidir; iki yeni zincir birlikte eski molekül kadar, yani 2000 nükleotit içerir. Türlere göre 600 A, 600 T, 400 G ve 400 C harcanır.
• Hidrojen bağları: Helikaz eski moleküldeki 2400 bağı koparır. İki yavru molekülün her birinde 2400 bağ yeniden kurulur; toplam 4800 yeni hidrojen bağı oluşur. Kopan ve kurulan sayısı bu yüzden eşit değildir.
• Fosfodiester bağları: Her yeni zincir 1000 nükleotitlik doğrusal bir zincirdir ve ardışık nükleotitler arasında birer bağ taşır: 999. İki yeni zincirde toplam 1998 fosfodiester bağı kurulur. Eski zincirlerin omurgası ise hiç kırılmaz.

Eşlenme art arda yinelenirse her turda molekül sayısı ikiye katlanır. Üç eşlenmeden sonra 8 molekül olur; bunların içindeki zincirlerin yalnız ikisi başlangıçtan kalmıştır. Yeni yapılan madde 7 molekül eder, yani 7 · 2000 = 14 000 serbest nükleotit, bunun 7 · 400 = 2800'ü guanin. Genel kural: n eşlenmede kullanılan serbest nükleotit, başlangıç molekülünün nükleotit sayısının (2ⁿ − 1) katıdır.

Prokaryot ve ökaryotta başlangıç noktaları

Bakterilerin halkasal DNA'sında eşlenme tek bir başlangıç noktasından başlar ve iki yöne ilerleyen çatallar halkanın öbür yanında buluşur. Ökaryot kromozomları ise çok daha uzun ve doğrusal DNA molekülleri taşır; her birinde çok sayıda başlangıç noktası bulunur. S evresi boyunca bu noktaların pek çoğunda kopyalama birlikte yürür; açılan bölgeler genişledikçe birbirine kavuşur. Böylece çok uzun bir molekül de S evresinin sınırlı süresi içinde kopyalanabilir.

Eşlenmenin sonunda iki yavru molekül, dizileri bakımından birbirinin ve ana molekülün aynısıdır. Ama bu harf dizisi henüz bir anlam taşımıyor gibi görünür: dört bazlı bir alfabe, proteinlerde kullanılan yirmi çeşit aminoasidi nasıl belirtir, DNA'nın hangi bölümüne bir «gen» denir? Sıradaki ders «Gen ve genetik kod» bu soruları açıyor: bazların üçerli gruplar hâlinde okunmasını, yani kodon kavramını ve şifrenin bütün canlılarda neredeyse ortak oluşunu inceliyor.

Örnek 1 — Üçüncü bölünmeden sonra tüp

Soru: İki zinciri de ¹⁵N içeren tek bir DNA molekülü taşıyan varsayımsal bir bakteri, ¹⁴N'li ortamda üç kez bölünüyor. Yarı korunumlu eşlenmeye göre oluşan DNA moleküllerinin yoğunluk dağılımı hangisidir?

• A) Dördü ağır, dördü hafif
• B) Tamamı ara yoğunlukta
• C) İkisi ara yoğunlukta, altısı hafif
• D) Biri ağır, biri ara, altısı hafif
• E) Dördü ara yoğunlukta, dördü hafif

Çözüm: Üç eşlenmede bir molekül 2³ = 8 moleküle ulaşır. İki ağır zincir hep ayrı moleküllerde, karşılarında birer hafif zincirle bulunur; bu iki molekül melezdir, kalan altısı iki hafif zincir taşır. A korunumlu modelin mantığıyla ağır molekül bırakıyor ve sayıyı da yanlış veriyor. B yalnız birinci kuşağa uyar. D'de ağır molekül yarı korunumlu eşlenmede hiç oluşmaz. E melez sayısının kuşakla arttığını sanmaktan doğar. Cevap: C.

Örnek 2 — Fotokopi modelinin öngörüsü

Soru: Gülfem'in «eski molekül bozulmadan kalır, kopyası baştan sona yenidir» sanısı doğru olsaydı, ağır DNA'lı bakteriler hafif ortamda bir kez bölündüğünde tüpte ne görülürdü?

• A) Ara yoğunlukta tek bant
• B) Ağır ve hafif yoğunlukta iki ayrı bant
• C) Ara ile hafif arasında tek bant
• D) Yalnız hafif yoğunlukta tek bant
• E) Ağır, ara ve hafif yoğunlukta üç bant

Çözüm: Bu sanı korunumlu modeldir. Eski molekülün iki ağır zinciri yeniden birleşir ve dipte bir ağır bant verir; iki yeni hafif zincir de bir araya gelip yukarıda hafif bir bant oluşturur. A yarı korunumlu ve dağınık modelin birinci kuşak öngörüsüdür. C dağınık modelin ikinci kuşağına aittir. D eski zincirleri yok sayıyor; E ise korunumlu modelde oluşamayan melez molekülü de ekliyor. Deneyde B görülmediği için bu model reddedildi. Cevap: B.

Örnek 3 — Bağ hesabı

Soru: Doğrusal yapıdaki 1200 nükleotitlik bir DNA molekülünün 350 nükleotidi sitozindir. Molekül bir kez eşlendiğinde kurulan yeni hidrojen bağı sayısı kaçtır?

• A) H = 1550
• B) H = 2900
• C) H = 1450
• D) H = 3600
• E) H = 3100

Çözüm: Sitozin 350 ise guanin de 350'dir; 1200 − 700 = 500 nükleotit adenin ile timine eşit bölünür, 250 A–T çifti olur. Eski moleküldeki hidrojen bağı 250 · 2 + 350 · 3 = 1550'dir. İki yavru molekülün her birinde 1550 bağ yeniden kurulduğundan toplam 3100 yeni bağ oluşur. A yalnız tek molekülü, yani koparılan bağları sayıyor. C ile B, A–T çiftine üç, G–C çiftine iki bağ yazan ters kuraldan gelir (tek molekülde 1450, iki molekülde 2900). D her nükleotide üç bağ vermiş. Cevap: E.

Örnek 4 — Enzimlerin sırası

Soru: Eşlenmenin bir bölgesinde görev alan enzimlerin iş sırası hangisinde doğru verilmiştir?

• A) DNA polimeraz, helikaz, DNA ligaz
• B) DNA ligaz, DNA polimeraz, helikaz
• C) Helikaz, DNA ligaz, DNA polimeraz
• D) Helikaz, DNA polimeraz, DNA ligaz
• E) DNA polimeraz, DNA ligaz, helikaz

Çözüm: Önce kalıp açığa çıkmalıdır: hidrojen bağlarını helikaz koparır. Sonra DNA polimeraz serbest nükleotitleri kalıba göre yerleştirip yeni zinciri uzatır. Ligaz en son çalışır, çünkü birleştireceği parçaların önce sentezlenmiş olması gerekir. A ve E kalıp açılmadan sentez başlatıyor; B ile C ligazı parçalar oluşmadan devreye sokuyor. Cevap: D.

• Yarı korunumluyu korunumlu sanmak. «İki eski zincir birlikte kalır, iki yeni zincir ikinci molekülü kurar» cümlesi korunumlu modeldir. Yarı korunumlu eşlenmede her yavru molekül, ana molekülden gelen bir zinciri yeni yapılmış bir zincirle eşler.
• Melez molekül sayısının kuşakla arttığını düşünmek. Başlangıçtaki iki ağır zincir hiç bölünmediği için melez molekül her kuşakta 2'dir; azalan yalnız onların toplam içindeki payıdır.
• Kopan ve kurulan hidrojen bağını eşit yazmak. Helikaz eski molekülün bağlarını bir kez koparır; iki yavru molekülde bu sayının iki katı yeniden kurulur.
• Fosfodiester bağını nükleotit sayısına eşitlemek. Doğrusal bir zincirde bağ sayısı nükleotit sayısından bir eksiktir ve eşlenmede yalnız yeni zincirlerin bağları kurulur.
• Enzimlerin işini karıştırmak. Hidrojen bağını koparan helikazdır; parçalar arasındaki boşluğu kapatan ligaz hidrojen bağı değil fosfodiester bağı kurar.
• Eşlenmeyi bölünmenin içine koymak. DNA interfazın S evresinde eşlenir; mitoz ve mayoz yalnız dağıtır, mayoz I ile II arasında eşlenme yinelenmez.